– Caged-fluo

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : La dynamique de protéines cellulaires (localisation, la motilité cellulaire, le trafic vésiculaire, les interactions avec d'autres protéines ou des lipides) constitue un des éléments clés de la biologie cellulaire. L'étude fine des différents mouvements et interactions exige que l'on puisse exercer un contrôle spatio-temporel afin d'élucider cette dynamique. La fluorescence, associée à la reconnaissance spécifique de protéines cellulaires, est un outil incontournable de visualisation dans les cellules. Les fusions de cDNA qui permettent de coupler directement la protéine d'intérêt avec une protéine auto fluorescente (GFP et dérivés), ont été intensément utilisées, mais également des fluorophores associés/couplés par modifications chimiques spécifiques (eg.SNAP-tag). Parallèle- ment, des protéines contenant un épitope (His-tag ou TetraCys-tag) ont été développées pour permettre une reconnaissance réversible et spécifique des fluorophores. Notre projet propose d'utiliser ces méthodologies de marquage en y associant un élément additionnel innovant, celui du contrôle spatio-temporel de la libération du signal. La conception et la synthèse de nouveaux fluorophores « cagés » pouvant répondre à une excitation bi-photonique afin d'améliorer le suivi spatial, devrait permettre de répondre à cette exigence. Ces sondes seront associées d'abord à des protéines individuelles connues (eg.l'actine et ses protéines régulatrices) en tant que modèles , puis serviront à l'étude de protéines de fonction inconnue et à des systèmes plus complexes, et ceci en utilisant des technologies d'imagerie de pointe. Ces développements technologiques sont destinés à l'étude des problématiques actuelles en biologie cellulaire; dans notre cas le rôle de nouvelles protéines dans la signalisation et le remodelage du cytosquelette d'actine. 2-Description du projet, méthodologie : Le présent projet propose la conception et la synthèse de nouveaux fluorophores cagés qui soient sensibles à une excitation en bi-photon destinés à être reconnus par, ou couplés à des protéines cellulaires pour en suivre leur dynamique intracellulaire. A cet effet nous proposons : 1) Le développement de fluorophores de la famille des coumarins pour permettre des synthèses totales à grande échelle avec les modifications chimiques indispensables à la réalisation de ce projet: mise en place des groupements photolabiles ou «cages». Ces «cages» possèdent des propriétés photolytiques remarquables (réaction efficace et excitation bi-photonique). 2) On devrait pouvoir, par des modifications chimiques simples, de moduler les longueurs d'ondes d'excitation et d'émission de fluorescence afin d'augmenter la couverture spectrale des coumarins. 3) Le développement et mise en place des motifs de reconnaissance des His-Tag et SNAP-tag originaux seront développés, permettant en particulier une meilleure pénétration cellulaire. 4) La mise au point du « uncaging » biphotonique appliquée aux motifs His-Tag et SNAP-Tag. 5) Le marquage de protéines cellulaires de référence, par exemple des protéines modèles du cytosquelette telles l'actine et une protéine de la famille WASP sera entreprise pour démontrer la faisabilité de la méthodologie. Les différentes constructions du cDNA seront effectuées avec un His-Tag et un SNAP-Tag. La qualité de la dynamique sera comparée à ceux de l'EGFP et/ou de la GFP photoactivable dans des cellules mammifères en utilisant une microscopie de pointe. 6) L'adaptation de cette technologie à d'autres modèles d'études tels le Drosophile et la levure. 3-Résultats attendus : Nous comptons développer et mettre en place l'utilisation de nouveaux fluorophores cagés, sensibles à une excitation biphotonique, ce qui devrait améliorer la résolution spatiale du signal fluorescent afin de mieux suivre la dynamique de protéines cellulaires. Le développement de ces nouveaux outils permettra de suivre, l'évolution d'une protéine et ceci à un ...