Processus physiopathologiques impliquant le récepteur de la prolactine : approches physico-chimiques dynamiques et structurales – PROLACTUMOR

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - Aux cours des dernières années, les arguments expérimentaux, cliniques et épidémiologiques impliquant le récepteur de la prolactine (PRLR) dans les pathologies tumorales bénignes et malignes affectant le sein et la prostate se sont accumulés. Cela a mis en lumière la nécessité de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques lorsque les approches classiques d'inhibition de production de PRL hypophysaire sont inefficaces. Le coordonateur de ce projet est internationalement reconnu comme un pionnier dans le développement d'une nouvelle classe de molécule : les antagonistes du PRLR. Si les résultats obtenus avec notre molécule lead sont très prometteurs, son amélioration en vue d'une utilisation thérapeutique future reste cependant limitée car des informations essentielles relatives au mécanisme d'activation du PRLR, et à sa biologie moléculaire et cellulaire au sens large, font actuellement défaut. Toujours dans le contexte tumoral, le coordonnateur vient d'identifier chez des patientes présentant une polyadénomatose mammaire (pathologie tumorale bénigne) deux mutants de PRLR possédant une activité constitutive. Au delà de suggérer fortement leur implication physiopathologique dans cette pathologie, nos observations font de ces récepteurs mutés des outils irremplaçables pour mieux comprendre le processus moléculaire d'activation du PRLR. L'objectif principal de ce projet fondamental interdisciplinaire est de décrypter ces mécanismes avec précision. Il possède un fort potentiel clinique et thérapeutique, comme l'illustre un partenariat industriel en cours sur les propriétés anti-tumorales des antagonistes actuels (non inclus dans ce projet). - - 2-Description du projet, méthodologie : - Le projet s'articule autour d'approches innovantes dans les domaines structuraux, biophysiques et cellulaires. Le partenariat implique 3 équipes, chacune largement reconnue dans son domaine de compétence, et dont la collaboration déjà effective a permis d'obtenir des résultats concrets (2 manuscrits en préparation). Un autre atout majeur est que de nombreux outils biologiques sont déjà disponibles, comme par exemple la banque de mutants de hPRL développés par le coordonnateur, et dont les propriétés vont du super-agonisme à l'antagonisme pur (lesquels découplent liaison et activation du récepteur). Un autre intérêt majeur est que la majorité des expériences seront réalisées en parallèle sur le récepteur sauvage et les mutants constitutivement activés. Au plan expérimental, les études structurales impliqueront l'analyse cristallographique des ligands (agonistes & antagonistes) et récepteurs (sauvages & mutés) d'intérêt, libres et en complexes. Pour la première fois, nous tenterons de déterminer la structure du récepteur entier. Les études biophysiques dynamiques (résonance des plasmons de surface et ultracentrifugation analytique essentiellement) impliqueront les récepteurs solubles recombinants et le récepteur entier dans un environnement lipidique, et viseront à caractériser la stoechiométrie des complexes ligand-récepteur et les paramètres cinétiques et énergétiques des interactions. Des configurations méthodologiques permettant de comparer les interactions des ligands avec un récepteur pré-dimérisé, ou dont la dimérisation est induite par le ligand, sont en cours de développement. Enfin, nous déterminerons la stoechiométrie des récepteurs (sauvages & mutés) sur cellules vivantes, au repos ou complexés aux différents ligands. Ceci sera analysé par des approches de BRET/FRET et électrophorèses non dénaturantes (BN-gels). Les cinétiques d'association du PRLR avec les molécules de signalisation (connues ou à identifier) seront également analysées selon les propriétés des ligands, par co-immunoprecipitation and BN-gels/spectroscopie de masse. L'implication du domaine transmembranaire dans les processus de dimérisation/activation du PRLR sera abordée par mutagenèse, selon les mêmes approches