– Nano-CESIWIN

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - Le noyau est un volume complexe qui contient le génome de la cellule dont le support physique est la fibre chromatinienne. Cette dernière est organisée en territoires chromosomiques séparés par un compartiment inter-chromatinien dans lequel sont situés les « corps nucléaires » (nucléoles, amas SC-35, PML). Malgré la très forte concentration moléculaire à l'intérieur du noyau, la chromatine est une entité très dynamique à chacun de ses niveaux d'organisation. Ainsi, les protéines nucléaires diffusent très rapidement et ont accès à l'ensemble des domaines nucléaires, y compris la chromatine condensée et les corps nucléaires. Par ailleurs, le maintien de la structure des corps nucléaires dépend des concentrations ioniques et de la « pression moléculaire » exercée par toutes les molécules. Ces différentes caractéristiques suggèrent que les ions et l'eau jouent un rôle crucial dans l'organisation nucléaire à une échelle nanométrique. Pour des raisons technologiques, aucune donnée n'a pu être acquise concernant l'eau à cette échelle. La levée récente de ce verrou technologique par le groupe de G. Balossier rend possible la réalisation de la cartographie de l'eau sur cryosection ultrafine de cellules directement cryofixées. L'expertise de nos deux groupes permettra de réaliser la première « Nano Cryo-Imagerie Spectrale Electronique de l'Eau et des Ions dans le Noyau » et d'étudier comment les cartographies de l'eau et des ions évoluent en fonction de la physiologie cellulaire. - 2-Description du projet, méthodologie : - Pour éviter la délocalisation des ions et de l'eau à l'intérieur du noyau, nous utiliserons les cryométhodes dont nous possédons l'expertise à savoir : la cryofixation, la cryocoupe et l'observation à très basse température (90K) dans un Cryo Scanning Transmission Electron Microscope (CSTEM). Nous avons développé deux méthodes complémentaires de mesure du contenu en eau à l'échelle nanométrique dans les différents compartiments subcellulaires. La première méthode, appelée Imagerie Champ Sombre Quantitative est basée sur les variations de l'intensité champ sombre en CSTEM. Elle fournit une mesure indirecte du taux d'hydratation à partir de cryocoupes de cellule lyophilisées. La seconde méthode est basée sur la spectroscopie des pertes d'énergie des électrons (EELS). Elle permet une mesure directe du taux d'hydratation à partir de cryocoupes de cellules hydratées. Nous avons développé deux méthodes complémentaires de localisation et de quantification élémentaire dans les différents compartiments subcellulaires. La première méthode se base sur la spectroscopie d'émission X par dispersion d'énergie (EDXS) pour la quantification des concentrations locales du sodium, chlore, potassium, soufre, magnésium et calcium. La seconde méthode permet d'obtenir des cartographies chimiques par imagerie spectrale EELS des éléments carbone, azote, oxygène et phosphore. Dans le but d'affiner l'identification des compartiments nucléaires, différentes approches seront utilisées :1) comparaison de coupes ultrafines des mêmes cultures préparées par cryométhodes et par techniques classiques ; 2) identification des compartiments par la quantification du rapport N/P ; 3) cartographie de l'eau et des ions dans des cellules dont un compartiment nucléaire est identifié par un marqueur fluorescent (DRAQ 5 pour l'ADN, protéines chimères-GFP (et dérivés) pour différentes protéines nucléaires) pour une comparaison des images obtenues en fluorescence et par cryométhodes (sections sériées, sections observées à froid en fluorescence puis en CSTEM, sections observées à froid en CSTEM puis en fluorescence). - 3-Résultats attendus : - La réalisation du présent projet permettra :1) de réaliser pour la première fois la cartographie de l'eau du noyau avec une résolution de 20 nm et de la compléter par la quantification locale les ions; 2) de connaître l'hétérogénéité des concentrations de l'eau et des ions à l'i...