– SYNMOD

1- Contexte scientifique et objectifs du projet. Notre objectif est de concevoir et développer des nucléases synthétiques spécifiques de séquence. Nous proposons de les utiliser pour mettre en œuvre des approches originales de mutagenèse dirigée. La possibilité de modifier de façon contrôlée le génome est essentielle dans tous les domaines de la biologie, autant pour la génomique fonctionnelle, la création d'organismes génétiquement modifiés d'intérêt expérimental, médical ou industriel, que dans des perspectives de thérapie génique. La recombinaison homologue le permet, mais son efficacité est le plus souvent insuffisante. Toutefois, elle peut être considérablement augmentée par une coupure double-brin. Grâce à l'élaboration de nucléases à doigts de zinc spécifiques de séquences, la société Sangamo a ainsi pu obtenir des taux de mutation dirigée de 1-10%. Pour une séquence donnée, l'élaboration de ce type de nucléases est en principe possible mais reste en pratique le facteur limitant de cette nouvelle approche. Pour créer de nouvelles nucléases capables d'induire des coupures ciblées du génome, nous avons choisi de coupler des ligands de l'ADN spécifiques de séquence à des agents capables de couper l'ADN. Comme ligands de l'ADN, nous utilisons les oligonucléotides formant des triple-hélices (TFO), des polyamides et des « peptide nucleic acids » (PNA). Les propriétés de ces différents ligands de l'ADN sont de mieux en mieux maîtrisées et permettent d'envisager de cibler un large répertoire de séquences d'ADN. 2- Description du projet, méthodologie. Plusieurs types de conjugués seront synthétisés. Comme agents de coupure, nous avons débuté avec l'orthophénanthroline et la camptothécine et des méthodes de synthèse à plus grande échelle seront développées afin de faciliter les tests biologiques (Partenaire 2). Deux autres approches seront étudiées pour améliorer les propriétés des nucléases synthétiques (Partenaire 1). La première exploitera nos résultats récents obtenus avec des conjugués de flavine à des ligands de l'ADN. Nous avons démontré qu'ils sont capables d'induire une coupure ciblée d'ADN intracellulairement et que le conjugué est capable de pénétrer dans les cellules. Ces caractéristiques prometteuses des conjugués à la flavine seront donc approfondies. Par ailleurs, pour augmenter la spécificité de coupure, une approche originale, exploitant la chimie des enediynes, sera testée. Elle repose sur l'utilisation de dérivés d'enedyine qui ne coupent l'ADN qu'en présence d'un activateur approprié. Enediyne et activateur seront couplés à des ligands spécifiques de séquences d'ADN adjacentes de sorte que la réaction de coupure ne devrait se produire que sur la séquence d'ADN ciblée. L'activité cellulaire de ces nouvelles nucléases synthétiques sera soumise aux analyses déjà mises en place pour les conjugués OP-TFO : immunomarquage de l'histone H2AX phosphorylée pour évaluer l'activité cellulaire de coupure double brin, quantification du taux de cibles endommagées par PCR quantitative, séquençage de la région autour de la cible après réparation cellulaire (Partenaire 1). Pour mieux apprécier la spécificité d'action des nucléases synthétiques, nous chercherons également à colocaliser le site ciblé et les protéines de réparation, cela grâce à des méthodes originales d'imagerie de séquence unique d'ADN (Partenaire 1). La méthode de modification génomique stimulée par les nucléases synthétiques sera testée et optimisée dans un système modèle, un gène rapporteur introduit en copie unique dans des cellules en culture permettant la quantification et l'analyse rigoureuse des événements de modification (Partenaires 1 et 3). Nos premiers résultats montrent qu'avec les conjugués OP-TFO, il est possible d'obtenir des taux de mutation comparable aux taux obtenus avec une coupure par l'endonucléase naturelle I-Sce1 (Partenaire 1). Une fois optimisée, cette nouvelle méthode sera donc utilisée sur plusieurs gènes endogènes afin de démontrer son intérêt en génomique fonctionnelle et pour la correction génique dans des maladies humaines (Partenaires 3). Dans la perspective d'applications thérapeutiques et de création d'organismes génétiquement modifiés, nous chercherons également par cette nouvelle méthode à créer des souris mutantes (Partenaire 3). 3- Résultats attendus. Ce projet repose sur les expertises complémentaires des trois partenaires et bénéficie des collaborations nécessaires pour son développement efficace. Il conduira à (i) la synthèse de molécules originales avec une activité ciblée de modification de l'ADN ; (ii) le développement de méthodes de haute sensibilité d'imagerie de séquences d'ADN par microscopie de fluorescence ; (iii) la caractérisation de certains aspects des mécanismes de réponse à l'induction de dommages génomiques ; (iv) la validation et le développement d'une nouvelle approche de modification dirigée du génome.