– THYMET

Contexte scientifique et objectifs: Les métabolismes du thymidylate et du folate sont des voies clés dans le développement d'agents antimicrobiens. Ces voies sont liées puisque les folates sont nécessaires dans la synthèse de métabolites précurseurs des acides nucléiques et des protéines. La production du thymidylate (dTMP), un précurseur essentiel de l'ADN, ainsi que beaucoup de modifications d'ARN sont réalisées grâce à des réactions de méthylation transformant des groupements uridyles en thymidyles. Jusqu'à récemment, deux enzymes, la thymidylate synthase ThyA et l'ARNt-méthyltransférase RUMT, étaient connues pour catalyser ces réactions. Bien que ces enzymes aient longtemps été considérées comme quasi-universelles, nous avons découvert deux nouvelles classes de flavoenzymes catalysant la formation de thymidine: la thymidylate synthase ThyX (formant du dTMP; Myllykallio et al. 2002) et l'ARNt-méthyltransférase TrmFO (Gid) (formant du m5U54-ARNt; Urbonavicius et al. 2005). Ces deux nouvelles méthyltransférases ne présentent aucune similarité de séquences, ni entre elles, ni avec d'autres méthyltransférases déjà décrites. Elles utilisent en revanche toutes deux le CH2H4folate comme substrat et la FAD comme cofacteur pour permettre le transfert d'hydrure au cours de la synthèse du thymidyle, indiquant qu'elles partagent un mécanisme chimique de réaction analogue, apparu deux fois de manière indépendante au cours de l'Evolution. Le but principal de notre projet est d'étudier et de comparer les étapes clés de leur réaction de méthylation en combinant des méthodes biochimiques, spectroscopiques et structurales. Un autre aspect de ce projet vise aussi à examiner si leurs différences mécanistiques avec les enzymes connues jusqu'alors, influencent (ou sont infuencées par) le métabolisme cellulaire. Il est à noter que les protéines essentielles ThyX et les protéines TrmFO, retrouvées chez plusieurs bactéries pathogènes, sont en revanche absentes chez l'Homme, laissant supposer que l'inhibition de la synthèse de thymidylate, folate- et FAD-dépendante, pourrait conduire à des applications biomédicales. Ce projet bénéficiera des résultats des études menées, in vitro et in vivo sur ThyX par le consortium, et ayant abouti à l'identification d'inhibiteurs site-actif et mécanisme-redox spécifiques, potentiellement optimisables. - Description du projet et méthodologie: Le consortium pluridisciplinaire présente des expertises considérables en biologie moléculaire, enzymologie, spectroscopie et analyses structurales. Nos études sur la catalyse et l'environnement du FAD dans les protéines ThyX seront facilitées par l'existence de nombreuses souches mutantes ThyX et des outils spectroscopiques permettant des analyses pointues de type steady-state et time-resolved , ainsi que par la grande expérience dans l'étude de réactions dynamiques et d'intermédiaires servant aux transferts d'électrons du partenaire 1. En utilisant des criblages automatisés (Brevets internationaux INSERM/CNRS/U. Paris-Sud), partenaire 2 a déjà identifié des inhibiteurs à la fois site-actif et mécanisme spécifiques, qui seront optimisés au cours du projet. Les inhibiteurs optimisés seront utilisés à la fois comme outils expérimentaux pour analyser l'ordre de fixation des substrats durant la catalyse par ThyX, mais aussi pour éclaircir de nouvelles caractéristiques du métabolisme des folates dans les bactéries thyX+. Des partenaires 2 et 3 effectueront des études structure-fonction des méthyltransférases TrmFO en utilisant des approches biochimiques et crystallographiques. - Résultats attendus: Ce projet permettra d'apporter des informations importantes sur le mécanisme chimique de réaction partagé par les flavoprotéines ThyX et TrmFO. Explorer l'environnement du FAD et les interactions flavine-flavine dans des protéines ThyX sauvages et mutantes, apportera des renseignements sur des changements fonctionnels du site actif et devrait permettre l'utilisation de l'énergie de t.