– PHELIN

"1-Contexte scientifique et objectifs du projet : - Les lipases catalysent l'hydrolyse des liaisons ester des triglycérides. Les recherches actuelles sur les lipases et leurs inhibiteurs sont très compétitives. Ces enzymes sont en effet impliquées dans d'importantes fonctions physiologiques dans le métabolisme des lipides et des maladies associées telles que l'obésité, l'athérosclérose et le diabète de type II. Plusieurs inhibiteurs réagissant avec la sérine catalytique des lipases sont connus, tels que l'Orlistat (THL), les oxadiazolones et les alkylphosphonates. Des inhibiteurs plus sélectifs sont cependant requis et les changements conformationnels du "volet" contrôlant l'accès au site catalytique des lipases doivent être pris en compte lors de leur conception. Le but de ce projet rassemblant des biochimistes (Équipe 1) et des chimistes (Équipe 2) est de concevoir des inhibiteurs immobilisés très réactifs et spécifiques pour l'identification, la quantification et l'isolement de lipases d'intérêt médical ou biotechnologique présentes dans des fluides ou matériaux biologiques complexes. Les Équipes 1 et 2 possèdent une longue expérience commune sur la synthèse d'inhibiteurs de type phosphonate, leur caractérisation cinétique et leur étude structurale à partir des structures 3D de plusieurs complexes lipase-inhibiteur obtenus. Individuellement, ces deux équipes sont expertes dans le domaine des lipases (Équipe 1) et celui de la chimie du phosphore (Équipe 2). - - 2-Description du projet, méthodologie : - Pour valider la "capture" de lipases à l'aide d'inhibiteurs supportés, nous synthétiserons dans une première étape des versions immobilisées d'inhibiteurs connus pour cibler des lipases modèles appartenant à cinq familles distinctes. Ces familles comprendront les principales lipases de mammifères et microbiennes d'intérêt médical. La conception d'inhibiteurs plus sélectifs pour chacune de ces lipases étant un des objectifs majeurs de ce projet, de nouveaux objets phosphorés hétérocycliques seront synthétisés en solution et en phase solide dans une seconde étape. Dans une troisième étape, la chimie combinatoire dynamique sera utilisée de façon innovante pour augmenter la sélectivité des inhibiteurs en termes de reconnaissance moléculaire des lipases. L'idée est ici de concevoir des inhibiteurs à « deux bras », l'un ciblé sur la reconnaissance du site actif, et le second sur celle de la surface entourant le site actif des lipases. L'utilisation de la chimie combinatoire dynamique en phase solide et appliquée aux lipases représente un second challenge de taille dans ce projet. - Tout au long de ces trois étapes, les interactions lipase-inhibiteur seront évaluées par des mesures d'activité enzymatique résiduelle et par l'utilisation de méthodes spectroscopiques permettant de caractériser ces interactions en se focalisant sur la protéine (ATR-FTIR) et/ou l'inhibiteur phosphoré (31P-RMN). - Les inhibiteurs obtenus seront utilisés pour une application biochimique essentielle : la "capture" spécifique de lipases dans des échantillons biologiques modèles (contenus intestinaux, prélèvements sanguins, extraits de plante). - - 3-Résultats attendus : - Nous souhaitons construire des outils pour : - (1) la capture et la détection de lipases connues dans des échantillons biologiques (sécrétions, homogénats de cellules et tissus, milieux de cultures). Il existe un fort besoin en outils de ce type pour remplacer les actuels tests d'activité, peu spécifiques. - (2) l'isolement de lipases inconnues à partir de fluides ou matériaux biologiques complexes, en vue de déterminer leur séquence protéique N-terminale et de les caractériser par spectrométrie de masse. - Les inhibiteurs de lipases obtenus au cours de ce projet pourront être utilisés ultérieurement pour des applications médicales (capteurs pour le diagnostique, traitement des maladies affectant le métabolisme des lipides) en fonction de leurs propriétés. - " ...