Mécanismes de régulation d'AID lors de la commutation isotypique. – CLASS SWITCHING-AID

Les lymphocytes B diversifient les fonctions des immunoglobulines par les processus de commutation isotypique (CI) et d'hypermutation somatique. Ces réactions sont initiées dans les cellules B du centre germinatif par l'enzyme AID (Activation Induced Cytidine Deaminase), qui induit des lésions de l'ADN. Ces processus ciblent les gènes des immunoglobulines (Ig), et très peu de dommages collatéraux sont subis par les autres régions génomiques de l'ADN. Cette restriction est mise en place, en partie, par des mécanismes contrôlant l'expression d'AID, sa localisation sub-cellulaire et son activité. Cependant, malgré des avancées récentes, les questions du mécanisme du ciblage d'AID vers le locus des Ig, de même que ceux par lesquels les dommages à l'ADN induits par AID sont réparés, restent largement irrésolues. Notre hypothèse est qu'AID fait partie d'un complexe multi-protéique qui contrôle son ciblage spécifique et favorise la réparation précise des lésions de l'ADN.//1. Identification des protéines associées à AID. Nous avons montré qu'AID fait partie d'un grand complexe qui comprend des protéines de réparation de l'ADN essentielles pour la CI, ainsi que le facteur de transcription Ikaros. Nous isolerons ce complexe, en déterminerons les composants, définirons ceux qui interagissent directement avec AID, et caractériserons les domaines d'AID impliqués. De plus, nous déterminerons si ce complexe de détection/signalisation/réparation des dommages à l'ADN est ciblé par AID vers les gènes des d'immunoglobulines in vivo. Finalement, le rôle dans l'HMS et la CI de composants individuels de ce complexe sera examiné par des expériences de gain ou perte de fonction.

2. Déterminer le rôle d'Ikaros dans la commutation isotypique. Nos données préliminaires montrent que la perte d'Ikaros chez la souris aboutit à des anomalies dans la transcription des régions de commutation et de la CI. Nous déterminerons si Ikaros joue un rôle dans le ciblage d'AID ou dans la régulation transcriptionelle du locus IgH pendant la CI par des expériences d'immunoprecipitation de la chromatine (CHIP), le séquençage des régions de commutation, et par la méthode 3C (chromosome conformation capture).

3. Déterminer les mécanismes moléculaires qui régulent la juxtaposition des régions de commutation lors de la commutation isotypique. Lors de la CI, les dommages à l'ADN induits par AID dans les régions de commutation sont réparés par un mécanisme qui exige la juxtaposition de séquences qui peuvent être distantes de 200 Kb. Comment cette juxtaposition est accomplie n'est pas bien compris. Nous utiliserons l'hybridiation in situ à fluorescence tridimensionnelle (3D-FISH) et la méthode 3C pour étudier les mécanismes moléculaires qui favorisent la juxtaposition précise des régions de commutation lors de la CI.
//Notre étude identifiera de nouveaux partenaires d'AID et définira les voies moléculaires régulant la fonction d'AID lors de la CI. Notamment, elle apportera un nouvel éclairage sur le rôle d'AID dans le ciblage de la machinerie de réparation, et sur les protéines recrutant AID vers ses cibles dans le locus Ig. En outre, si nous trouvons qu'Ikaros cible AID vers des sites spécifiques, nous aurons identifié le premier facteur de recrutement d'AID. Nos études devraient aussi révéler un rôle clé d'Ikaros dans les interactions entre promoteurs et enhancer dans ce locus, un résultat qui serait une percée importante dans la compréhension de la régulation transcriptionnelle de la sélection isotypique. Finalement, nous définirons les voies impliquées dans la synapse des régions de commutation lors de la CI, avant ou après induction des lésions à l'ADN. Tous ces résultats devraient éclairer sous un jour nouveau les mécanismes centraux qui régissent la diversification des anticorps.