Nouvelles stratégies pour obtenir une intégration contrôlée et une expression fiable des transgènes chez les poissons et les mammifères. – TRANSINTEX

La microinjection est une technique très utilisée pour obtenir des animaux transgéniques, même si on peut mettre en œuvre des transposons, des vecteurs lentiviraux, l'ICSI et le clonage. La microinjection de gène se traduit par une intégration relativement peu fréquente de l'ADN qui s'organise en concatémères de structure variable et incontrôlée, accompagnée de remaniements et d'une expression des transgènes assez imprévisible. Cela est particulièrement vrai chez les animaux modèles aquatiques car l'ADN doit être injecté dans le cytoplasme où les réarrangements sont plus fréquents. Le site d'intégration des transgènes est non contrôlé, ce qui se traduit par une extinction des transgènes ou par une expression ectopique. Les transgènes s'intègrent de préférence dans des régions du génome où se trouvent des gènes de l'hôte, ce qui à pour effet de les inactiver dans environ 10% des cas. Ceci impose de préparer un nombre élevé d'animaux transgéniques fondateurs et de les examiner pour ne garder que les plus utilisables. Cette situation a pour conséquence un contrôle limité de l'expression des transgènes et de leurs effets secondaires sur leurs hôtes et sur l'environnement. L'imprécision des méthodes de transgénèse a de plus un coût animal et un coût financier qu'il est souhaitable de réduire, en particulier pour des applications médicales et agroalimentaires. Pour améliorer l'efficacité de la transgénèse réalisée par microinjection chez l'embryon ainsi que pour réduire ses effets négatifs, les trois approches suivantes sont proposées.
1) L'addition de longues séquences d'ADN génomique. L'utilisation de longs fragments d'ADN génomique permet souvent d'obtenir une expression fiable des gènes qu'ils contiennent (gènes du locus ou gènes étrangers qui y ont été introduits). Le partenaire 1 a une expérience de cette approche avec un gène exprimé spécifiquement dans le lait, le gène WAP (whey acidic protein). Un BAC (bactérial artificial chromosome) contenant le gène WAP porcin exprime très bien ce gène chez des souris transgéniques. Ce BAC sera utilisé pour exprimer des gènes étrangers qui y seront introduits par recombinaison dans des bactéries avec le système Red/ET. Le vecteur BAC modifié sera introduit dans les animaux par microinjection. Ce vecteur sous cette forme ou sous une forme compacte contenant les éléments régulateurs essentiels pourra être utilisé pour produire des protéines recombinantes d'intérêt pharmaceutique par l'entreprise BioProtein Technologies. Cette stratégie sera étendue à un autre BAC contenant le gène eF1-???Ce gène est fortement exprimé dans tous les types cellulaires. On peut supposer que la chromatine dans l'environnement de ce gène conserve une structure favorable pour l'expression de la majorité des gènes qui y seront introduits. Les gènes étrangers devraient ainsi pouvoir s'exprimer de manière satisfaisante avec une spécificité définie par les promoteurs qui leur sont associés.
2) L'amélioration de la qualité des insertions. La coinjection d'un gène de sélection et du gène d'intérêt est souvent pratiquée afin d'obtenir une cointégration des deux unités de transcription permettant ainsi la sélection des animaux transgéniques exprimant le gène d'intérêt. Cependant, les réultats obtenus ne permettent pas de sélectionner correctement les animaux intéressants, les réarrangements entre les gènes et les phénomènes d'extinction perturbant profondément l'expression des deux unités de transcription. Une amélioration reposera sur l'utilisation de vecteurs bicistroniques contenant le gène d'intérêt et un gène de sélection. De tels vecteurs doivent pour cela contenir une IRES (internal ribosome entry site) qui permet au deuxième cistron d'être traduit. Ceci évitera de coinjecter le vecteur contenant le gène d'intérêt et celui contenant le gène de sélection. Les réarrangements complexes entre les deux constructions n'auront ainsi plus lieu (partenaire 4).
3) L'intégration ciblée des gènes étrangers. L'intégration ciblée des gènes étrangers permet de s'affranchir de la plupart des artéfacts décrits plus hauts. Ce mode d'intégration repose sur une recombinaison homologue. Celle-ci est peu fréquente et ne peut être utilisée en direct que dans des cellules capables de participer au développement d'un organisme portant le gène étranger et capable de le transmettre. Ceci suppose la construction d'animaux chimères à l'aide de cellules pluripotentes (ES ou EG) ou l'obtention d'animaux clonés à partir de cellules dans lesquelles le ciblage de gènes a eu lieu. Ces techniques deviennent progressivement opérationnelles mais ne peuvent être encore aisément utilisées en routine. Cette difficulté peut être contournée en s'appuyant sur un phénomène observé il y a plusieurs années. La coupure locale des deux brins d'ADN par une méganucléase augmente considérablement le taux de recombinaison homologue. Le site I-SceI sera donc introduit en copie unique i) par microinjection directe dans le génome de poissons à l'aide d'une intégrase C31 (partenaire 3), ii) par microinjection d'un vecteur BAC dans lequel le site I-SceI aura été introduit préalablement de façon ciblée (partenaires 1, 2). Les gènes étrangers (introduits dans l'embryon par microinjection en présence de l'enzyme I-SceI) seront alors intégrés de manière préférentielle dans les régions où l'ADN aura été coupé par la méganucléase. Alternativement, des méganucléases préparées par Cellectis pour être spécifiques de sites génomiques naturels seront utilisées chez les poissons. Les gènes étrangers pourront ainsi être intégrés systématiquement dans des sites connus.