Contrôle de l'inactivation épigénétique des transgènes et diagnostic d'instabilité de l'expression génique – Diagnogene

La fiabilité d'une plante transgénique dépend de la stabilité physique des transgènes insérés et de la continuité de leur expression au cours du développement de la plante transformée et de ses descendants. Les études menées sur les plantes transgéniques depuis la fin des années 80 ont révélé que les transgènes peuvent subir des modifications épigénétiques qui affectent leur expression sans modifier leur séquence nucléotidique. Ces modifications épigénétiques résultent de l'activation de mécanismes cellulaires de défense de la plante visant naturellement à limiter les infections virales ou bactériennes, ou à contrôler le mouvement des éléments transposables, et qui reconnaissent les transgènes comme des séquences invasives qui doivent être neutralisées. Ces mécanismes d'inactivation épigénétiques conduisent soit à un blocage de la transcription (transcriptional gene silencing, TGS) soit à une dégradation des ARNs (post-transcriptional gene silencing, PTGS).

L'utilisation de mutants déficients pour le TGS et/ou le PTGS permet de s'affranchir de ces problèmes et de stabiliser l'expression des transgènes. Toutefois, ces mutations présentent des effets secondaires : dérégulation de gènes du développement, hypersensibilité aux virus, et/ou perte de contrôle du mouvement des transposons, qui limitent leur utilisation dans des programmes de transgenèse. De plus, ces mutants ne sont disponibles que chez des espèces modèles de laboratoire comme Arabidopsis thaliana. Par transformation de plantes sauvages, il est parfois possible d'identifier des transformants chez lesquels l'insertion d'un transgène n'active pas la machinerie de TGS ou de PTGS. Le locus transgénique n'est pas reconnu comme un élément étranger et n'est donc pas inactivé. Toutefois, l'inactivation peut mettre plusieurs générations pour se mettre en place, laissant parfois planer un doute sur la stabilité d'un transgène. Il est donc nécessaire de développer un test diagnostic permettant d'identifier ces loci sur un critère moléculaire afin de rationaliser le choix des événements de transformation aux étapes précoces du criblage.

Nous nous proposons d'identifier des mutants d'Arabidopsis thaliana présentant une hyper-susceptibilité à déclencher le TGS et/ou le PTGS et d'utiliser ces mutants pour rechercher des loci transgéniques résistants au silencing. Dans un premier temps, nous identifierons et caractériserons les gènes cellulaires affectés chez les mutants d'hyper-silencing afin de déterminer la place qu'ils occupent au sein des différentes voies de silencing. La conservation de ces mécanismes sera explorée par la recherche de mutants dans des gènes homologues chez Medicago truncatula à l'aide des outils de génétique inverse (e.g. TILLING). Dans les deux espèces, nous déterminerons si ces gènes codent pour des suppresseurs endogènes de silencing en les sur-exprimant dans des plantes transgéniques et en regardant si la susceptibilité à déclencher le TGS et/ou le PTGS est diminuée. Nous transformerons ensuite les mutants d'hyper-silencing par des transgènes sélectionnables capables de déclencher le silencing efficacement chez des plantes sauvages et nous rechercherons des loci transgéniques naturellement résistants au TGS et/ou au PTGS. Enfin, nous caractériserons ces loci afin d'identifier les signatures moléculaires de résistance au silencing. Ces études, menées en parallèle sur une espèce modèle de laboratoire (Arabidopsis thaliana) et une légumineuse (Medicago truncatula), permettront de mettre en place un diagnostic permettant de repérer les loci susceptibles d'assurer une expression stable des transgènes au cours des générations dans divers programmes de transgenèse