Rôle de ShcA and PPAR gamma dans le contrôle de l'athérosclérose – Shc,PPAR, athero

RESUME PROJET – Contexte scientifique et objectifs: La prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) induite par le PDGF intervient dans la formation des lésions athéroscléreuses. Nous avons montré que le lipoprotein receptor-related protein (LRP1) et le récepteur au PDGF coopéraient et protégeaient contre l'athérosclérose. Les souris déficientes en LRP1 dans les CMLV sont très sensibles à l'athérosclérose et les lésions sont caractérisées par une activation de la voie du PDGF avec hyperprolifération cellulaire. Le traitement de ces souris par un agoniste PPARg diminue la prolifération des CMLV et l'athérosclérose. Le LRP1 agit probablement grâce à sa partie cytoplasmique. Il reste à identifier les candidats responsables du contrôle de l'athérosclérose au niveau intracellulaire. Ce projet vise à caractériser le rôle de deux protéines, impliquées dans la signalisation intracellulaire induite par les facteurs de croissance et partenaires potentiels de LRP1, dans le développement de l'athérosclérose : ShcA et PPARgRESUME PROJET – Description: But 1- caractérisation in vitro du rôle du LRP1 sur l'activation de ShcA
Modèles cellulaires : cellules sauvages ou déficientes en LRP1
- influence de LRP1 sur le trafic intracellulaire de ShcA : stimulation des cellules par des facteurs de croissance impliqués dans l'athérosclérose (PDGF, IGF-I) et analyse de la distribution de ShcA dans les différents compartiments intracellulaires (ultracentrifugation, western blot, immunofluorescence, construction ShcA-GFP, microscopie confocale)
- influence de LRP1 sur la phosphorylation de ShcA : stimulation des cellules par PDGF, IGF-I et immunoprécipitation de ShcA, western-blot antiphosphotyrosine
- ShcA et LRP1 font-ils partie d'un même complexe de signalisation ? : stimulation des cellules par PDGF, IGF-I et expériences d'immunoprécipitation avec anticorps contre LRP1, ShcA ou les récepetrus au PDGF et l'IGF-I
- Influence du LRP1 sur le recrutement de protéines impliquées dans la signalisation conduisant à la prolifération : stimulation des cellules par PDGF, IGF-I et expériences d'immuniprécipitation et western-blot pour caractériser le recrutement de Grb2, l'activation de Ras et de ERK1/2
But 2- caractériser in vivo l'importance de ShcA dans le développement de l'athérosclérose
- génération de souris ShcAflox/flox pour établir un knockout conditionnel (Cre-recombinase)
- caractérisation des souris déficientes en ShcA spécifiquement dans les CMLV
- caractérisation des souris déficientes en ShcA spécifiquement dans les cellules endothéliales
But 3- caractériser les souris déficientes en PPARg ou PPARg/LRP1 spécifiquement au niveau des CMLV
Histologie, western-blot, immunohistochimie, microdissection avec capture laser et profil transcriptionel
- caractérisation des souris déficientes en PPARg spécifiquement au niveau des CMLV
- caractérisation des souris déficientes en PPARg/LRP1 spécifiquement au niveau des CMLV
RESUME PROJET – Resultats attendus: But 1- Nos résultats préliminaires montrent un rôle pour le LRP1 dans le contrôle de la phosphorylation et du trafic intracellulaire de ShcA. Nous pensons démontrer que ShcA est un important partenaire intracellulaire de LRP1 et que le contrôle de la prolifération cellulaire par le LRP1 nécessite la modulation de la cascade de signalisation intracellulaire qui dépend de ShcA.
But 2- Nous avons achevé la construction du vecteur cible pour l'électroporation des cellules ES. Nous pensons que la suppression de ShcA dans les CMLV protégera contre l'athérosclérose. La suppression de ShcA soit dans les CMLV soit dans les cellules endothéliales permettra de caractériser la contribution de ShcA spécifiquement dans chaque type cellulaire.
But 3- Nos premiers résultats montrent que dans les CMLV, le gène PPARg joue un rôle athéroprotecteur in vivo. L'analyse des lésions permettra de caractériser les mécanismes mis en jeu in vivo pour permettre un effet atheroprotecteur de PPARg.