Contrôle de la sensibilité à l'insuline du tissu adipeux par la protéine Grb14 : conséquences physiologiques d'une modulation de l'expression de Grb14, et développement d'agents insulino-sensibilisateurs inhibant l'interaction Grb14/récepteur – Grb14

La protéine Grb14, qui est exprimée spécifiquement dans les tissus cibles de l'insuline, se lie sur le récepteur de l'insuline (RI) activé en réponse à la stimulation hormonale. On observe une augmentation de l'expression de Grb14 dans le tissu adipeux de patients diabétiques de type 2, ainsi qu'une corrélation entre le niveau d'expression de Grb14 et la diminution de sensibilité à l'insuline dans des modèles animaux d'insulinorésistance. In vitro, Grb14 inhibe l'activité tyrosine kinase du RI en agissant comme un pseudosubstrat. Le projet comporte 3 volets majeurs : 1) Etude biochimique et physiologique des conséquences de modifications de l'expression de Grb14 dans les adipocytes; 2) Analyse moléculaire de la spécificité de l'interaction entre Grb14 et le récepteur de l'insuline 3) Criblage visant à identifier des molécules capables de bloquer le recrutement de Grb14 sur le RI. Les molécules identifiées seront testées pour leur action insulino-sensibilisatrice.
Les conséquences métaboliques de la surexpression de Grb14 ou de son inhibition par ARN interférence seront étudiées dans des lignées adipocytaires 3T3-L1 exprimant la protéine ou un shRNA de façon inductible (système Tet on/Tet off). La différenciation adipocytaire, l'expression et la sécrétion d'adipokines, ainsi que les effets de l'insuline sur l'activation de ses effecteurs, le transport de glucose, la lipogénèse et la lipolyse seront analysés. Une lignée de souris transgénique permettra d'étudier l'effet de la surexpression de Grb14 dans le tissu adipeux (AdGrb14) sur la régulation du métabolisme glucidique et lipidique. Des souris WT et AdGrb14 seront soumises à différents régimes alimentaires, afin de mesurer l'impact de la surexpression adipeuse de Grb14 dans l'apparition de l'insulinorésistance consécutive à un régime hyperlipidique. Les profils métaboliques et hormonaux seront analysés, ainsi que le développement et l'histologie du tissu adipeux. Des tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline seront réalisés.
La description de la structure cristallographique du complexe Grb14/récepteur permet de développer une stratégie de mutagénèse dirigée visant à identifier les acides aminés clés responsables de la spécificité de l'interaction des deux protéines. L'interaction des protéines mutantes sera testée par trois approches complémentaires : co-immunoprécipitation, BRET, et par leur action inhibitrice sur la maturation des ovocytes de xénope. La structure du complexe Grb14/RI a également permis de repérer 2 poches qui vont servir de base à un crible in silico de molécules susceptibles de s'y lier (structure-based virtual ligand screening). Les molécules présentant le meilleur score de liaison seront ensuite testées pour leur activité biologique. Pour identifier des molécules empêchant l'interaction Grb14/récepteur nous ferons parallèlement un criblage de la chimiothèque nationale de Strasbourg par la technique de BRET sur cellules vivantes.
Ces études vont nous permettre de démontrer et quantifier l'impact de l'action inhibitrice de la protéine Grb14 sur la signalisation insulinique dans le tissu adipeux, et donc de valider Grb14 comme cible importante du contrôle de l'action de l'insuline. La deuxième partie du projet devrait aboutir à l'identification de molécules capables de bloquer le recrutement de Grb14 sur le récepteur de l'insuline activé, et donc de s'opposer à son action inhibitrice sur la signalisation insulinique. De plus, la validation du crible proposé en BRET pour détecter des molécules inhibant l'interaction Grb14/récepteur pourra déboucher sur le développement d'un crible à haut débit (HTS) auprès d'un industriel. Face à l'augmentation épidémique de l'obésité et du diabète de type 2, deux pathologies caractérisées par une résistance à l'insuline, une molécule capable d'améliorer l'action de l'insuline présente un