– ReguLipids+

1-Contexte scientifique et objectifs du projet : La compréhension moléculaire de la régulation de la synthèse de lipides chez les bactéries Gram+ reste fragmentaire. Afin de dévoiler les mécanismes d'intégration du signal dans deux voies clés de l'homéostase de lipides chez Bacillus subtilis, on se focalisera sur deux protéines ayant un rôle central, DesK et FapR. La synthèse d'acides gras insaturés est fortement contrôlée en réponse au choc thermique froid, via un système à deux composants. Ce système comporte une histidine-kinase trans-membranaire, DesK, dont on a récemment résolu la structure 3D du domaine cytoplasmique. DesK détecte une baisse de température, s'autophosphoryle et transfère ensuite le phosphate à son partenaire régulateur DesR pour réguler in fine l'expression d'une désaturase clé. On veut comprendre quelle est la nature du signal détecté par DesK et comment cette protéine est capable d'intégrer ce signal et le transmettre en aval. FapR est une protéine qui réprime la transcription de presque tous les gènes qui codent pour les enzymes de synthèse d'acides gras. Nous avons résolu la structure 3D d'un des deux domaines de FapR en démontrant qu'il fixe directement l'effecteur positif: le malonyl-coenzymeA. Notre hypothèse actuelle postule que la fixation du malonyl-CoA déclenche un réarrangement conformationel majeur, aboutissant au décrochage de FapR du site opérateur sur l'ADN. FapR est un régulateur global très conservé chez les bactéries Gram+. La validation de notre hypothèse contribuera ainsi à l'identification et la conception de nouvelles molécules antibiotiques. 2-Description du projet, méthodologie : L'équipe du coordinateur dispose des constructions recombinantes qui permettent l'expression de FapR et DesK entières et de leurs sous-domaines, solubles et hautement purifiées. On utilisera une approche combinant des disciplines venant de la biologie et de la physique. La diffraction de rayons X à l'état cristallin pour continuer nos travaux en cours visant à résoudre les structures 3D des différentes protéines libres ou complexées avec leurs partenaires/ligands spécifiques: DesK entière (en incluant son domaine transmembranaire), seule et associée à DesR; FapR entière complexée à l'ADN et/ou au malonyl-CoA. Les comparaisons détaillées des structures à haute résolution obtenues dans l'étude des voies de signalisation, généreront et/ou valideront les hypothèses mécanistiques à tester par mutagenèse dirigée et des expériences fonctionnelles. Les structures cristallographiques 'statiques' seront complémentés par des techniques physiques permettant l'étude des protéines en solution. La spectroscopie RMN et la caractérisation thermodynamique complète des protéines cibles seront d'intérêt prioritaire. On envisage des développements méthodologiques dans le domaine de l'analyse des données de dynamique conformationelle en RMN, ainsi qu'en thermodynamique structurale pour expliquer les phénomènes coopératifs. Dans les deux systèmes étudiés, on envisage l'application de méthodes de bioinformatique structurale permettant la conception de petites molécules sur la base de l'information structurale et dynamique obtenue, et en particulier, des mimétiques du malonyl-CoA incapables de déclencher l'induction transcriptionelle. La synthèse des molécules candidates résultant des analyses virtuelles permettra de les caractériser in vitro et les valider in vivo. 3-Résultats attendus : La structure 3D de la forme entière de DesK représente un objectif ambitieux mais d'un grand impact en ce qui concerne la compréhension de la nature du signal et comment DesK l'intègre et déclenche son activité His-kinase. L'étude de l'association de DesK et DesR nous éclairera aussi sur d'autres éléments en aval, coordonnés de façon précise au niveau moléculaire avec la perception du signal. Dans le cas de FapR, notre travail permettra de valider expérimentalement l'hypothèse actuelle de transduction de signal par voie conformationelle. Nous nous concentreront sur les effets induits par la molécule signal et les événements qui en résultent immédiatement permettant à FapR de transmettre cette information. L'étude de FapR entière, seul et en complexe avec les ligands spécifiques, sera pour cela très importante. Enfin, l'identification et l'obtention de molécules inhibant l'association de FapR et DesK à leurs ligands spécifiques servira à valider les hypothèses structurales ainsi qu'à obtenir des antibiotiques nouveaux contre les bactéries Gram+.