Thérapie génique de maladies humaines associées à des mutations de l'ADN mitochondrial: mise au point de modèles cellulaires exploitant l'adressage d'acides nucléiques dans les mitochondries – MINATAR

Les maladies neuromusculaires sont souvent causées par des mutations dans le génome mitochondrial (ADNmt). L'incidence de ces maladies est de l'ordre de 1:10 000. A ce jour, il n'existe aucun traitement efficace. La thérapie génique pourrait apporter une solution, au moins partielle, à ce problème. Un des participants à cette demande a récemment démontré que la voie d'import des ARNt dans les mitochondries pouvait être exploitée pour complémenter une mutation de l'ADNmt associée au syndrome MERRF. Le deuxième participant a démontré la possibilité d'importer des molécules d'ADN dans les mitochondries humaines isolées. La troisième équipe dispose de nombreuses lignées cellulaires humaines déficientes et des techniques pour leur analyse fonctionnelle. L'objectif de notre projet est d'utiliser les différentes voies d'adressage d'acides nucléiques dans les mitochondries pour la mise au point de la complémentation fonctionnelle des mutations d'ADNmt dans des modèles cellulaires humains.
Les anomalies délétères de l'ADNmt sont des mutations ponctuelles ou des grands remaniements de taille: délétions et/ou duplication. Ces anomalies sont, pour la plupart, hétéroplasmiques: les génomes mutés et sauvages coexistent dans les mitochondries. La thérapie génique des maladies associées aux mutations de l'ADNmt peut suivre 3 stratégies : (1) l'expression allotopique d'un gène d'intérêt dans le noyau et l'adressage du produit de son expression dans la mitochondrie; (2) l'introduction dans la mitochondrie d'agents inhibant de manière sélective la réplication des génomes mitochondriaux mutés, stratégie dite anti-génomique ; (3) l'introduction dans la mitochondrie d'un gène exprimant le produit d'intérêt. Nous proposons de développer ces différentes stratégies en exploitant les voies d'import des acides nucléiques. Nous allons utiliser l'import d'ARN de transfert pour complémenter des mutations pathogènes dans des gènes d'ARNt ou l'import d'ARNt suppresseur pour compenser des mutations non-sens dans des gènes de protéines. Nous testerons également la possibilité d'utiliser l'import naturel de l'ARNr 5S pour introduire dans les mitochondries des oligoribonucléotides ayant une activité anti-réplicative des génomes mutés. Enfin, nous allons développer l'import dirigé d'ADN dans les mitochondries in vivo et tester si l'expression de transgènes à partir de l'ADN incorporé permet une complémentation des mêmes types de mutations dans les gènes mitochondriaux. La complémentation sera testée dans des cellules humaines cybrides, lignées immortalisées contentant l'ADN muté de patients, et, si possible, dans des cellules primaires de patients. Ces diverses approches sont rendues possibles grâce à l'effort intégré des trois équipes impliquées, expertes dans les domaines de l'import mitochondrial d'ARN (équipe 1) ou d'ADN (équipe 2), ainsi que dans le diagnostic des mutations délétères de l'ADNmt et la construction de lignées transmitochondriales (équipe 3).
Le projet a pour objectif une caractérisation du degré de flexibilité des voies d'adressage d'acides nucléiques dans les mitochondries humaines et l'exploitation de cette information pour modéliser, dans les cellules en culture, la thérapie génique de maladies causées par des mutations de l'ADNmt. Les expériences proposées devraient démontrer s'il est possible d'adresser dans les mitochondries humaines des molécules d'acides nucléiques (ARN ou ADN), spécifiquement conçues pour complémenter différents types de mutations pathogéniques de l'ADNmt : mutations ponctuelles dans des gènes d'ARNt ou de protéines et délétions. Tout en reconnaissant que l'outil que nous proposons de développer n'est que la première étape de la mise au point d'une thérapie, nous soulignons que la création de modèles adéquats est cruciale. Nous pensons donc que le développement de protocoles de thérapie effective ne sera possible que si nos expériences avec des modèles cellulaires donnent des résul