Virus de la grippe: entrée et bourgeonnement – FluBudEntry

Les mécanismes d'entrée et sortie du virus de la grippe reposent sur des déformations membranaires engendrées par des protéines virales. Lors de l'entrée, la fusion membranaire entre les membranes virales et cellulaires est assurée par l'hémagglutinine HA. Le travail de Wiley et Skehel a permis de déterminer deux conformations de HA, caractéristiques du repliement de HA avant (pré-) et après (post-) la fusion. Malgré cette grande quantité d'information, le mécanisme de fusion reste incertain. Pour mieux comprendre ce phénomène, nous étudierons HA avec les méthodes que nous avons appliquées avec succès sur les protéines des alpha, des flavi et des rhabdovirus : la corrélation des données obtenues par radiocristallographie et cryo-microscopie électronique. Lors de la sortie du virus de la grippe, la protéine de matrice M1 change la courbure des membranes et assure le recrutement de HA. Nous étudierons comment différentes souches, aviaires et humaines, contrôlent ces paramètres.
L'étude de l'entrée et du bourgeonnement du virus influenza sera étudiée comme suit:
I. Etude des intermédiaires structuraux de la HA en interaction avec les membranes
A. Production des protéines
Différentes HAs de virus aviaires et humains seront étudiées. Elles seront soit purifiées à partir du virus, soit produites en système recombinant. Des formes solubles ou entières seront exprimées dans deux systèmes différents : le système baculovirus/sf9 ou en cellules Schneider 2 (S2). Quatre types de VLPs humaines ou aviaires seront produites. Elles seront constituées de HA et M1 avec ou sans M2 et/ou NA.
B. Propriétés fusogènes et criblage d'une banque chimique pour trouver un inhibiteur
Les essais de fusion de membranes contenant HA et des membranes cibles seront réalisés avec des liposomes contenant un fluorophore membranaire. Avec cette technique, une banque chimique sera criblée pour trouver un inhibiteur du mécanisme de fusion.
C. Assemblages de HA formés en présence de membranes biologiques. Une étude par cryo-microscopie électronique
La protéine isolée des virus ou recombinante sera étudiée par cryomicroscopie électronique, analyse d'image et diffusion des rayons X aux petits angles.
II. Etude du mécanisme d'assemblage des VLPs
A- Recrutement des protéines. Nous déterminerons la spécificité de souche dans l'interaction entre M1 et les protéines d'enveloppe. Plus précisément, nous déterminerons si la M1 codée par les virus humains H1N1 et H3N2 est capable de recruter efficacement la H5 d'un virus aviaire.
B- Morphologie des VLPs. Une particularité des virus influenza est qu'ils deviennent généralement sphériques avec l'adaptation à la culture cellulaire. Ces propriétés sont liées à des mutations des gènes M1 et NA. Nous déterminerons les résidus critiques des protéines M1 et NA de virus aviaires virulents ou non.
Le but majeur de notre projet est d'isoler des intermédiaires de conformations de HA apparaissant lors du phénomène de fusion membranaire. Le succès de ce projet demande d'étudier de nombreuses souches de virus ayant différents paramètres cinétiques de fusion. Deuxièmement, le fait que, selon l'espèce, les virus infectent le système respiratoire ou entérique pose une importante question concernant la stabilité de HA à bas pH. Nous voulons répondre à cette question en étudiant la structure de HA en interaction avec des membranes à différents pH et température. Un troisième but à ce projet concerne la recherche d'une molécule inhibant le phénomène de fusion et d'entrée. Cette recherche sera faite en criblant une banque de produits chimiques. Finalement, la production de pseudo-particules virales (VLP) associées à un système de génétique inverse nous permettront de mieux comprendre l'assemblage du virus de la grippe.