Analyse structurale et fonctionnelle de Cernunnos, un nouveau facteur de la réparation de l'ADN essentiel au système immunitaire – DNA repair

RESUME PROJET – Contexte scientifique et objectifs
Le système immunitaire est le site de modifications importantes de l'ADN introduites durant la maturation des lymphocytes ou lors des phases de prolifération et d'activation cellulaire au cours des réponses immunes. Un système performant de réparation des lésions de l'ADN est nécessaire non seulement au développement des lymphocytes T et B mais également probablement à leur homéostasie en périphérie. Notre suivi des pathologies de Déficit Immunitaire Combiné Sévère (DICS) caractérisées par une lymphopénie profonde associée à d'autres défauts développementaux nous a permis d'identifier un groupe de patients présentant un défaut de réparation des lésions de l'ADN. Ces patients portent des mutations dans un gène, Cernunnos, que nous avons identifié par complémentation fonctionnelle. Nous proposons d'étudier la structure et la fonction de Cernunnos in vitro et in vivo comme paradigme pour l'analyse du rôle des facteurs de réparation d'ADN dans différents aspects du système immunita
RESUME PROJET – Description
Le facteur Cernunnos ayant récemment été identifié, tout reste à faire pour en comprendre la fonction. Voici les questions principales que nous aborderons: (1) quelle est la fonction précise de Cernunnos au cours de la réparation de l'ADN? (2) Cernunnos joue-t-il un rôle pendant la commutation de classe des Ig? (3) Cernunnos est-il important pour l'homéostasie lymphocytaire? (4) un défaut de Cernunnos peut-il participer au développement de leucémies?
Pour aborder ces questions nous adopterons une double approche, qui tire profit du recrutement unique de patients DICS à l'hôpital Necker et par la conception de nouveaux modèles animaux. L'identification de mutations de Cernunnos chez les patients présente un intérêt considérable pour l'établissement de rapports structure/fonction pour cette protéine.
En utilisant les techniques conventionnelles nous créerons une souris KO conditionnelle de Cernunnos en introduisant deux sites LoxP dans le génome. Ces souris seront analysées pour une éventuelle létalité embryonnaire suite à la suppression du gène ainsi que pour l'effet d'un défaut de Cernunnos dans le système immunitaire. L'utilisation de plusieurs souris transgéniques Cre permettra l'analyse spécifique du rôle de Cernunnos à différentes étapes de la vie des lymphocytes. En utilisant la technologie de transgénèse lentivirale, que nous avons récemment implémentée, nous créerons une souris transgénique Cernunnos-TAP. Ce modèle murin permettra d'évaluer les conséquences d'une expression non régulée de Cernunnos. A partir de populations lymphocytaires purifiées ex vivo de ces souris Tg, nous rechercherons des partenaires physiologiques de Cernunnos par la purification des complexes protéiques, en utilisant l'étiquette TAP fusionnée à Cernunnos et la spectrométrie de masse. Finalement, des souris Cernunnos KO conditionnelles seront croisées sur un fond P53-/- pour évaluer le développement d'hémopathies malignes dans divers contextes de défauts de Cernunnos.

RESUME PROJET – Resultats attendus
1) L'analyse fonctionnelle et biochimique des mutations de Cernunnos identifiées chez les patients et générées par mutagenèse dirigée nous permettra de déterminer les régions et acides aminés critiques à la fonction de cette protéine et de préciser les relations qui existent entre Cernunnos et d'autres facteurs de la réparation tels que XRCC4 et ADN-LigaseIV.
2) Le développement d'une souris KO conditionnelle pour Cernunnos permettra d'analyser le rôle particulier de Cernunnos dans différentes composantes du système immunitaire (CSR, homéostasie lymphocytaire, développement thymique) et permettra de préciser l'éventuelle létalité embryonnaire d'un défaut complet.
3) L'utilisation des souris KO conditionnelles pour Cernunnos sur un fond KO pour P53 permettra d'évaluer le rôle de «gardien de l'intégrité génétique» joué par Cernunnos.
4) Les souris transgéniques Cernunnos-TAP permettront d'ide