Caractérisation des domaines DBL liant le CSA des variants de PfEMP1 impliqués dans le paludisme placentaire – DBLPAM

Certains domaines DBL de variants de la famille de protéines PfEMP1 permettent la séquestration des hématies infectées au chondroitine sulfate A (CSA), à l'origine du paludisme placentaire. L'immunité naturelle induite par ces domaines DBL liant le CSA confère une protection. La présence d'épitopes cross-réactifs dans ces domaines suggère qu'ils sont des candidats pour un vaccin contre le paludisme placentaire. Ce projet est centré sur la caractérisation des domaines DBL liant le CSA de PfEMP1 de parasites placentaires. L'objectif principal est de produire ces domaines DBL recombinants solubles et correctement repliés, d'en déterminer la structure 3D, et d'étudier leurs interactions avec le CSA et des anticorps spécifiques. Les données structurales, protéomiques et fonctionnelles permettront de comprendre la fonction biologique de ces domaines, d'optimiser des constructions recombinantes pour un vaccin, et de définir une base structurale pour des médicaments antipaludiques.
Nous exprimerons les domaines DBL liant le CSA d'isolats placentaires pour des études structurales, protéomiques et fonctionnelles. Les domaines recombinants DBLg; (VAR1CSA), DBLX et DBLe; (VAR2CSA) d'isolats placentaires seront obtenus en système baculovirus/cellule d'insecte. Leur structure sera déterminée par cristallographie aux rayons X. Une étude protéomique en MS/MS identifiera les PfEMP1 exprimés par des parasites placentaires. L'analyse fonctionnelle comprendra des études de liaison et d'immunogénicité. Nous évaluerons la liaison des domaines DBL liant le CSA aux CSPG purifiés de placenta humain, aux sections placentaires et à une culture de trophoblastes humains. La capacité de ces domaines à inhiber l'adhésion d'isolats placentaires ou de souches adhérentes au CSA sera mesurée par compétition. Leurs propriétés seront aussi étudiées par résonance plasmonique de surface, et leur immunogénicité par ELISA sur des sérothèques de femmes enceintes. Les données seront comparées aux titres d'anticorps anti-VSA par cytométrie en flux et à l'inhibition d'adhésion des mêmes plasmas.
Des mAbs seront produits contre les DBL liant le CSA, et leur fonction testée. Les DBL seront co-cristallisés avec les fragments Fab des mAbs capables d'inhiber l'adhésion, les préparations de CSA étant trop hétérogènes pour l'étude cristallographique. Le site de liaison au CSA sera défini par mutagenèse dirigée et criblage fonctionnel des mutants. Les PfEMP1 de la membrane de parasites placentaires du Bénin seront identifiés par 1D SDS PAGE, électrophorèse blue native et LC-MS/MS. Pour déterminer le site de liaison au CSPG, des PfEMP1 libres et liés au CSPG seront modifiés chimiquement, digérés par la trypsine et analysés par MALDI/MS. Des différences de profil trypsique et de variation de masse des peptides indiqueront des différences d'accessibilité au solvant, précisant la région impliquée dans la liaison au CSPG.
La connaissance de la distribution tridimensionnelle des résidus polymorphes et des épitopes protecteurs, ainsi que l'identification du site récepteur dans la structure tridimensionnelle, faciliteront l'optimisation de constructions vaccinales. Plus généralement, l'information structurale pourra être extrapolée à d'autres classes de DBL. Les résultats prévus sont les suivants:
Protocoles pour l'expression et la purification de domaines homogènes et correctement repliés;
Corrélats structurels et fonctionnels de l'adhésion au CSA et protection immune (déterminants antigéniques protecteurs, distribution des sites polymorphes);
Identification des variants PfEMP1 à la surface de parasites placentaires, et définition du site de liaison au CSA;
Optimisation de constructions recombinantes pour validation préclinique d'antigènes;
Disponibilité du site de liaison au CSA pour identifier des molécules bloquant la séquestration dans le placenta