Le virus Chikungunya: analyse structurale et fonctionnelle de protéines non-structurales ayant un rôle central dans la pathogenèse virale – CHIKVIRULENCE

Le virus Chikungunya (CHIKV) est un petit virus encapsulé à ARN + simple-brin, du genre Alphavirus, de la famille des Togaviridae. L'extrémité 5' code pour les 4 protéines non-structurales nsP1-4 nécessaires à sa réplication. Les résultats préliminaires du consortium indiquent que les protéines non-structurales nsP2 et nsP3 jouent un rôle majeur dans les mécanismes de mort cellulaire/apoptose déclenchés par CHIKV.
Le projet vise à démontrer la capacité de CHIKV à déclencher la pathogenèse et la mort par apoptose des cellules humaines. Les propriétés fonctionnelles et structurales de nsP2 et nsP3 permettront de guider des analyses génétiques inverses, sur les souches de CHIKV isolées en Afrique de l'Ouest et Est/Centrale, Asie, La Réunion ainsi que le virus O'Nyong Nyong. Les principaux outils utilisés seront : l'analyse génomique/phylogénétique, la production et la cristallisation de protéines recombinantes, les clones infectieux et mini génomes et l'analyse biochimique/fonctionnelle.
Le consortium propose une approche intégrée basée sur la génomique structurale et des méthodes de pointe en virologie appliquées à l'étude des interactions hôte-pathogène.
WP1 : Analyse génomique, le séquençage du génome, couplé à l'analyse génétique : du phénotype, de la distribution géographique et de l'évolution seront effectués sur les principales lignées d'isolats CHIKV disponibles. Les séquences pertinentes seront sélectionnées pour exprimer des protéines individuelles, polyprotéines et leurs mutants suspectés d'intervenir dans l'apoptose.
WP2: Un clone infectieux sera construit à partir de l'isolat CHIKV le plus pertinent. UAM2 fournira des clones d'expression dans des vecteurs adaptés aux expériences : études mutationelles, d'expression transitoire, des interactions protéine-protéine et d'expression destinées à la cristallographie.
WP3 : Cristallographie, le CNRS va déterminer la structure 3D et caractériser fonctionnellement le macro-domaine nsP3, en se basant sur l'homologie avec le macro-domaine du Coronavirus SARS dont il a déterminé la structure cristallographique. De même, le domaine nsP2 codant pour l'hélicase du CHIKV sera obtenue grâce à l'homologie avec la nsP2 du virus Semliki Forest disponible au CNRS, afin de déterminer sa structure 3D et d'effectuer sa caractérisation fonctionnelle.
WP4 : Une étude de génétique inverse et l'évaluation du phénotype des cellules apoptotiques seront menées afin de répondre aux questions liées à l'apoptose dans les cellules infectées par CHIKV. IP étudiera le rôle de nsP2 et du macro domaine dans la pathogenèse de CHIKV, ainsi que les voies cellulaires impliquées dans la cascade apoptotique. L'expression constitutive ou inductive des séquences nsP2 et macro domaine (natives ou mutantes) sera étudiée dans des cellules infectées. UAM2 aura accès à des clones infectieux ADNc du CDC et pourra générer des mutants et un clone infectieux spécifique du variant de La Réunion pour des études de pathogénicité in vivo.
Séquençage du génome viral : définition de la variabilité génétique et domaines fonctionnels des nsPs et obtention de l'information pour la synthèse de clones infectieux complets. Résultats : 10 séquences génomiques complètes. Analyse évolutive et fonctionnelle de la conservation des résidus dans les protéines cibles.
Etudes structurelles et fonctionnelles des nsPs par cristallographie à rayons X et enzymologie, selon les enzymes alphavirales connues pour être impliquées dans l'apoptose (hélicase et macro-domaine). Résultats : Structures cristallographiques des domaines nsP2 et macro et analyse mutationnelle basée sur la structure. Dosages biochimiques et caractérisation des protéines.
Analyse fonctionnelle par génétique inverse des gènes nsPs impliqués dans le déclenchement (ou le blocage) de la pathogénicité/apoptose. Résultats : rôle fonctionnel des protéines nsPs, seules