– MITOTRAD

Les mitochondries possèdent leur propre machinerie de traduction, qui est d'origine génétique double, nucléaire et mitochondriale, et permet la synthèse de quelques sous-unités essentielles de la chaîne respiratoire. La traduction mitochondriale est l'étape majeure de contrôle de l'expression des gènes, et représente un enjeu important car c'est la cible la plus fréquente des mutations mitochondriales humaines. Cependant, la levure modèle Saccharomyces cerevisiae n'est pas toujours le modèle le plus adapté pour étudier cette fonction mitochondriale. En effet, dans cet organisme, (1) les défauts de traduction peuvent déstabiliser l'ADN mitochondrial (ADNmt) ce qui rend leur étude difficile, (2) certains des facteurs de traduction généralement universels ne sont pas retrouvés dans la mitochondrie, et (3) les ARN mitochondriaux (ARNm-mt) possèdent de larges régions flanquantes, transcrites mais non traduites, qui sont la cible d'activateurs de traduction spécifiques d'un ARNm. Ces activateurs ne sont pas conservés ou ont divergé rapidement au cours de l'évolution. Au contraire, la levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, présente de nombreux avantages en tant que système modèle complémentaire : (1) les mutants perdant l'ADNmt sont naturellement létaux, et peuvent donc être contre-sélectionnés facilement, mais si besoin peuvent être combinés à une mutation nucléaire pour permettre leur viabilité, (2) le lot de facteurs de traduction bactériens pour lesquels on trouve un homologue dans le génome de S. pombe est quasiment le même que celui trouvé chez les eucaryotes supérieurs, (3) les séquences flanquantes des ARNm-mt sont très courtes ou inexistantes, car l'ADNmt de S. pombe est très compact, ce qui rappelle les ARNm-mt des mammifères, qui n'ont pas de séquences flanquantes. Cette ressemblance de structure suggère que les ARNm-mt de S. pombe et des mammifères pourraient être traduits selon des mécanismes similaires. De manière intéressante, nos premières études sur des facteurs d'élongation de la traduction ont montré que le blocage de la traduction mitochondriale entraîne une très forte déplétion d'ADNmt, phénomène encore jamais décrit chez les levures mais observé dans certaines maladies humaines. L'ensemble de ces constatations conforte l'idée que S. pombe représente un modèle à la fois pertinent et original pour étudier la traduction dans un organisme unicellulaire dont la physiologie est proche de celle des cellules humaines. Nos objectifs sont d'identifier et d'étudier chez S. pombe les facteurs nucléaires protéiques impliqués dans la traduction mitochondriale. Pour cela, nous utiliserons (1) une approche de gènes candidats, consistant à analyser des gènes dont la séquence permet de prédire leur implication dans la traduction mitochondriale, et (2) des cribles génétiques permettant d'isoler des mutants de traduction pouvant correspondre à de nouveaux facteurs. La première approche permettra d'étudier aussi bien les facteurs impliqués dans la traduction de tous les ARNm-mt, que ceux, plus rares, dont les homologues sont requis pour traduire un seul ARNm-mt chez S. cerevisiae. Pour cela, les gènes correspondants seront délétés et les mutants analysés au niveau biochimique, moléculaire et génétique. Nous testerons aussi la complémentation par le(s) gène(s) humain(s) homologue(s). La deuxième approche consistera en l'utilisation d'une collection de mutants respiratoires déjà disponible au laboratoire, alliée à la mise en place de la transformation balistique de la mitochondrie de S. pombe. Cette technique permettra d'insérer dans l'ADNmt un gène rapporteur, qui représentera un outil précieux pour isoler et étudier des mutants incapables de produire la protéine rapporteur, parmi lesquels nous nous intéresserons aux mutants de traduction et aux gènes correspondants. La transformation balistique sera aussi utilisée pour muter l'ADNmt, afin d'étudier les séquences en cis importantes pour la traduction mitochondriale. Dans..