GPN-loop GTPases H1H2H3 trio essentiel et conservé au cours de l'évolution des eucaryotes interagissant avec MBD2 & XPA – GPN-GTPases

Un nouveau groupe de GTPases a été identifié par génomique comparée. Nous avons résolu la structure originale d'une de ces GTPases d'Archaea, prototype de la nouvelle famille que nous avons dénommé GPN-loop GTPases clairement distincte des petites protéines G et des GTPases de type SRP54. Chaque génome eucaryote comprend trois paralogues (GPN- H1, H2 & H3 chez l'Homme). La protéine GPN-H1 (alias XBA1/MBDin) interagit avec XPA (réparation de l'ADN) et MBD2 (répression de la transcription). Nous avons démontré expérimentalement que H1/H2 et H1/H3 existent sous forme hétérodimèriques et que la localisation subcellulaire de H1 dépend de ces complexes. Nous proposons une approche intégrée pour définir la fonction de ces trois GTPases. Nous analyserons leur transit nucléo-cytoplasmique, identifierons quels stress ou conditions cellulaires induisent leur relocalisation au noyau et leur interaction avec XPA et MBD2, et décrirons les mécanismes moléculaires sous-jacents. A partir de la structure de la protéine dimèrique PAB0955, nous avons proposé des modèles structuraux 3D de chaque paralogue humain. Pour définir leur fonction, trois approches complémentaires seront combinées : - Caractérisation biochimique et structurale des complexes H1/H2 et H1/H3 : purification et test de l'activité GTPase, mutagenèse dirigée pour définir les résidus impliqués dans cette activité, cristallisation afin de déterminer le rôle spécifique du domaine C-terminal de H1, - analyse en terme de sensibilité aux dommages de l'ADN du phénotype de cellules humaines traitées par siRNA afin d'atténuer l'expression de chacun des gènes codant H1, H2 et H3 (les trois gènes homologues chez la levure sont essentiels), analyse de leur localisation subcellulaire par microscopie confocale lorsque les paralogues sont co-exprimés dans des cellules de mammifères (in cellulo), cartographie des signaux d'import et d'export nucléaire, évaluation de l'activité GTPase sur la localisation subcellulaire, et identification des stress cellulaires (tels que dommage ADN, drogues et métaux lourds) induisant leurs relocalisation au noyau et colocalisation avec leurs partenaires XPA et MBD2, - identification par protéomique de nouveaux partenaires de ces GTPases (notamment des partenaires spécifiques des complexes H1/H2 et H1/H3) en utilisant les paralogues co-exprimés ou des chimères comme appât. Par cette combinaison d'approches in silico (prédiction structurale pour une mutagenèse rationnelle), in cellulo (expression de constructions humaines dans des cellules de mammifères, microscopie confocale), in vivo (phénotype lors d'atténuation de l'expression par siRNA) et in vitro (caractérisation biochimique et structurale des hétérodimères purifiés), nous devrions préciser le rôle cellulaire de chacun des trois paralogues et déterminer leur influence sur leurs partenaires. La description du rôle et du mode de fonctionnement de ces GTPases pourrait éclairer notre compréhension de l'apparition des eucaryotes et leur évolution.