Quantification des flux métaboliques: un outil pour appréhender la régulation du métabolisme chez le fruit de tomate – tomatoflux

L'objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la qualité du fruit de tomate. La notion de qualité du fruit repose principalement sur des propriétés organoleptiques, nutritionnelles, de conservation et sur des teneurs en vitamines et antioxydants pour des considérations liées à la santé. La composition finale d'un fruit dépend largement de l'importation du saccharose et de son métabolisme au cours des différentes phases de son développement. La connaissance et la compréhension du métabolisme du fruit de tomate sont donc essentielles pour en améliorer la qualité. Récemment, le séquençage des génomes et les technologies dites 'omics' ont permis d'identifier les processus métaboliques mis en jeu chez les plantes et en particulier chez la tomate. La plus part des fonctions du métabolisme du fruit sont maintenant connues mais une question demeure : Comment ces processus fonctionnent et sont régulés in vivo pendant le développement du fruit ? Pour répondre à cette question, nous proposons de combiner l'analyse des voies métaboliques, la métabolomique et la fluxomique afin d'obtenir une image détaillée du réseau métabolique de la tomate permettant d'étudier les changements métaboliques associés au développement du fruit. L'enjeu est important car le métabolisme est complexe en terme de taille (métabolisme primaire et secondaire), de compartimentation cellulaire et de redondance des voies métaboliques mises en jeu. Pour prendre en compte cette complexité, ce projet inclura à la fois des développements méthodologiques afin d'accroître la quantité des données expérimentales accessibles et la modélisation du réseau métabolique. Ce projet inclura 4 étapes à mener en parallèle : 1) Le réseau métabolique du fruit de tomate sera reconstruit grâce aux données déjà disponibles (enzymes, métabolites, coenzymes, effecteurs…). Ces informations seront rassemblées dans une base de donnée avant d'être utilisées pour établir des connexions entre les intermédiaires métaboliques. Une analyse topologique du réseau métabolique, basée sur l'étude des modes élémentaires, permettra de réaliser une étude fonctionnelle du réseau. Un outil complémentaire sera développé pour interfacer la base de données au logiciel existant de calcul de flux (13CFLUX). De plus, le logiciel sera enrichi pour l'automatisation de la saisie des données et la génération d'interfaces graphiques afin d'obtenir des images de flux métaboliques d'après les données de marquage. Ce travail sera réalisé par des informaticiens du LaBRI, en relation avec l'équipe de l'UMR PBV. 2) Les expériences seront réalisées sur le fruit de tomate pour mesurer les flux métaboliques à deux stades de développement : 20 Jours Après Anthèse (JAA) et stage orange (début de la maturation) (UMR PBV). Ces expériences font appel à des dosages de métabolites et à des marquages isotopiques sur temps courts (pulse avec traceurs radioactifs 14C) ou sur temps long (état stationnaire avec traceurs enrichis en 13C). Les expériences seront menées sur des plantes sauvages et sur des plantes transformées affectées directement sur le métabolisme primaire (transformant RNAi pour la malate synthase) ou sur le métabolisme secondaire (transformants synthèse vitamine C) avec des répercutions sur le métabolisme primaire. 3) La génération des plantes à étudier sera réalisée à l'UMR PBV. Pour l'obtention des plantes transformant RNAi pour la malate synthase, la transformation se fera sous le contrôle d'un promoteur fruit spécifique et stade de développement spécifique (promoteur E8). La caractérisation phénotypique de ces plantes sera réalisée par l'analyse du métabolome (RMN du 1H) et du transcriptome. Les plantes affectées pour la synthèse de la vitamine C sont déjà disponibles et phénotypiquement caractérisées (UMR PBV). 4) Pour atteindre la complexité du réseau métabolique du fruit de tomate des développements méthodologiques sont nécessaires pour la métabolomique et la fluxomique. Ces développements seront réalisés afin de (1) diminuer la durée des étapes de purification et (2) augmenter le nombre et la précision des métabolites analysés. Ces développements seront réalisés à l'UMR PBV et au LBB pour la métabolomique et au LBB pour la fluxomique (RMN 1D et 2D, LC-MS/MS). Enfin, l'analyse du réseau métabolique (mesure des flux) sera réalisée -sur les plantes sauvages- par la comparaison des deux stades de développement où déjà de grands changements métaboliques ont été caractérisés par biochimie et génomique (répression ou induction de voies métaboliques). Cette comparaison permettra (1) de tester la capacité du modèle à mettre en évidence les modifications métaboliques et (2) de caractériser quantitativement ces modifications. Par la suite, nous comparerons le métabolisme des plantes sauvages et des transformants afin de quantifier les changements métaboliques et afin d'enrichir les connaissances issues des autres disciplines (transcriptomique, métabolomique..).