Mécanisme moléculaire d'encapsidation du génome dans un virus bactérien – PacVir

L'encapsidation d'ADN dans des procapsides préformées est une stratégie générale pour la condensation du génome viral à des concentrations très élevées dans le volume restreint de la capside virale. Dans les virus bactériens (bactériophages) avec une queue et dans les virus herpès ce processus implique la formation d'un complexe composé par l'ADN et une ATPase virale, la terminase, qui interagit avec le sommet portal de la procapside formant le moteur d'encapsidation de l'ADN. La translocation mécanique du génome viral à travers le canal de la protéine portale dodécamérique utilise l'énergie fournie par l'activité ATPase de la terminase. Ce processus est normalment achevé par la coupure de l'ADN viral suivie de la fermeture de la structure portale. L'encapsidation de l'ADN du bactériophage SPP1 avec des composants purifiés a été reproduite récemment in vitro et la structure de sa protéine portale gp6 a été determinée. C'est donc un excellent système pour étudier l'organisation et la dynamique du moteur moléculaire de translocation de l'ADN. Notre projet émanant de deux equipes de l'Unité de Virologie Moléculaire et Structurale emploie une combinaison de génétique, biochimie et biologie structurale pour étudier les mécanismes moléculaires toujours inconnus qui sont mis en jeu à differentes étapes de l'encapsidation du génome viral des bactériophages caudés et des virus herpès : 1. Assemblage du moteur d'encapsidation de l'ADN au niveau du sommet portal : définition de l'ordre d'interaction des composants du moteur, de leur stochiométrie et organisation structurale. Les complexes ternaires ADN-terminase-procapside seront purifiés. Leur caractérisation biochimique permettra de définir les besoins pour la réaction d'assemblage, ainsi que de caractériser les interactions entre les composants du moteur et la stabilité du complexe. Des études avec des protéines portales mutantes visent à identifier une forme de gp6 susceptible de bloquer la translocation d'ADN mais sans altérer l'interaction avec la terminase. Nous comptons produire, dans de telles conditions, un complexe ternaire composé de la terminase, de l'ADN et de la procapside qui représente un stade figé du moteur responsable de la translocation mécanique de l'ADN viral. Les images des complexes obtenues par cryomicroscopie électronique seront utilisées pour obtenir une reconstruction du moteur. Le docking de la structure atomique de gp6 dans la reconstruction permettra d'interpréter la conformation de la protéine portale dans le complexe. 2. Mécanisme de translocation de l'ADN : caractérisation du mécanisme de conversion de l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP en mouvement mécanique de l'ADN et des changements structuraux subits par les différents composants du moteur. Des réactions de translocation d'ADN viral in vitro seront conduites soit (i) en présence d'analogues non hydrolysables d'ATP qui bloquent l'activité ATPasique de la terminase, la source énergétique du moteur ; soit (ii) avec des procapsides portant des protéines portales qui dans des conditions oxydantes bloquent réversiblement la translocation mécanique de l'ADN. L'étude biochimique et structurale de ces complexes figés vise à identifier des changements conformationels dans leurs composants associés au processus de translocation de l'ADN. Les reconstructions du moteur obtenues par cryo microscopie electronique apporteront ainsi un premier apperçu de la séquence d'événements moléculaires qui assurent sa fonction. La structure connue de gp6 suggère que ceux-ci impliquent des mouvements d'hélices dans la proteine portale. Des ponts disulfures entre les hélices alpha supposées changer de position dans chaque sous-unité ou entre des sous-unités adjacentes ont été créés par génie génétique afin de tester cette hypothèse. Finalement, l'effet de l'incorporation de sous-unités inactives dans le dodécamère portal vise à definir si les sous-unités de la portale agissent sur l'ADN de façon concertée ou séquentielle