Le complexe IKK dans l'activation de la voie canonique et alternative de NF-kappaB – IKK complex

La famille des facteurs de transcription NF-kB joue un rôle clef dans la réponse immune et inflammatoire, le contrôle de la prolifération cellulaire, la différenciation et l'apoptose, et est impliquée dans le développement de nombreuses pathologies humaines, telles que les maladies inflammatoires et auto-immunes. Bien que de très nombreux stimuli activent NF-kB, toutes les voies de signalisations décrites à ce jour convergent au niveau du complexe IKK. IKK est composé de deux sous-unité catalytiques, IKKa et IKKb, et d'une sous-unité régulatrice, NEMO/IKKg. Nous avons précédemment montré que IKKa (partenaire 1) et NEMO/IKKg (partenaire 2) exercent des fonctions biologiques qui leur sont spécifiques, et qu'elles sont nécessaires à l'activation de voies NF-kB différentes, respectivement la voie alternative et la voie canonique. Néanmoins, les mécanismes moléculaires aboutissant à l'activation du complexe IKK en réponse à un stimulus donné ne sont pas connus, leur élucidation étant un des objectifs phares dans le domaine. L'activation de NF-kB par la voie canonique utilisée par les cytokines pro-inflammatoires, les produits bactériens ou après reconnaissance d'un antigène, nécessite NEMO/IKKg alors que IKKa n'est pas essentielle, et est négativement régulée par la déubiquitinase CYLD. Nous allons essayer de comprendre comment NEMO/IKKg participe à ce processus en caractérisant, au niveau moléculaire, les mutations ponctuelles de NEMO/IKKg causant les maladies génétiques Incontinentia Pigmenti et Dysplasie Ectodermique Anhidrotique avec Immunodeficience (partenaire 2). Des cellules déficientes pour NEMO/IKKg seront complémentées par des versions mutées de NEMO/IKKg et l'impact de ces mutations sur l'activation de NF-kB en réponse à différentes classes de stimuli sera évalué, ainsi que leur effet sur l'interaction de NEMO/IKKg avec ses partenaires connus. Nous allons aussi essayer de définir la fonction exacte de CYLD in vivo en analysant des souris exprimant conditionnellement une forme catalytiquement inactive de CYLD et en étudiant différents types cellulaires issus de ces animaux (partenaire 2). Dans notre équipe, nous avons récemment caractérisé une nouvelle voie d'activation de NF-kB, appelée voie alternative d'activation de NF-kB, qui est induite par différents membres de la superfamille du TNF, tels que BAFF et la lymphotoxineb (partenaire 1). De façon remarquable, contrairement à la voie canonique, l'activation de la voie alternative nécessite IKKa et non NEMO/IKKg et IKKb. Nous allons étudier comment IKKa participe à l'activation de la voie alternative en caractérisant biochimiquement le complexe contenant IKKa indépendamment de NEMO/IKKg que nous avons récemment isolé. La fonction biologique des nouveaux partenaires de IKKa que nous aurons pu identifier sera ensuite déterminée (partenaire 1). Nous allons aussi définir le transcriptome contrôlé par la voie alternative dans les lymphocytes B primaires stimulés par BAFF par criblage de puces à ADN de haute densité, identifier les cibles directes de cette voie d'activation, et étudier leur rôle dans le contrôle de la prolifération et l'induction de l'apoptose (partenaire 1). Finalement, les partenaires 1 et 2 ont élaboré en collaboration une stratégie génétique destinée à identifier de nouvelles molécules participant au processus d'activation de NF-kB. Nous allons générer une lignée cellulaire qui exprime, sous le contrôle de NF-kB, une forme modifiée de la caspase 3 qui n'est plus sensible à ses inhibiteurs naturels. Après transfection par une banque de RNAi couvrant le génome, les cellules seront induites par différents stimuli, tels que la lymphotoxineb, un inducteur de la voie alternative dans ces cellules (partenaire 1), et des agents génotoxiques (partenaire 2). Les clones survivants seront alors isolés et leur contenu en ARNi sera analysé. Cette approche devrait permettre d'identifier des molécules impliquées dans des voies de signalisation connues pour activer NF-kB.