– P0-SUPP

Face au mécanisme de défense anti-virale du PTGS (post-transcriptional gene silencing) développé par les plantes, les phytovirus ont adopté diverses stratégies basées sur l'expression de protéines virales appelées « suppresseurs » capables d'interférer avec ce mécanisme. A ce jour, de nombreux suppresseurs viraux de PTGS ont été identifiés mais seul un mode d'action qui repose sur la séquestration des siRNA a été caractérisé. Nos derniers travaux portant sur le suppresseur de silencing P0 codé par les polerovirus (Pazhouhandeh et al., 2006) ont permis de proposer un nouveau mécanisme de suppression basé sur la poly-ubiquitination d'un facteur cellulaire cible de la voie du PTGS. Cette modification signerait l'adressage de ce facteur vers le protéasome 26S et sa dégradation ultérieure, bloquant ainsi la cascade du RNA silencing. L'objectif de ce projet de recherche vise en premier lieu à identifier la (ou les) cible(s) reconnue(s) par la protéine P0, afin de comprendre le mécanisme d'action de ce suppresseur original codé par les polerovirus. Ce projet s'inscrit également dans un cadre plus vaste d'investigations, en apportant un éclairage nouveau à certaines étapes du PTGS, la voie la moins bien caractérisée du RNA silencing chez les plantes. Enfin, ces travaux présentent un attrait certain car ils établissent pour la première fois une passerelle entre deux thématiques fortes dont les recherches sont particulièrement intensives au plan international : le RNA silencing et la dégradation ubiquitine-dépendante par le protéasome. Le programme de recherche que nous proposons de développer comporte deux axes principaux : d'une part l'identification du/des facteurs cellulaires reconnus par la protéine P0 et la confirmation de leur adressage vers le protéasome, et d'autre part l'étude du rôle du PTGS dans la spécificité phloémienne des polerovirus. Le premier axe comporte deux étapes principales: (1) l'évaluation de l'interaction entre la protéine P0 et certaines protéines candidates, en particulier AGO1 (collaboration avec D. Baulcombe, GB), et (2) la recherche de manière non ciblée d'autres facteurs capables d'interagir avec la protéine P0. La partie (1) s'appuie sur des techniques classiques d'interaction (double hybride dans la levure, GST-pulldown, co-immunoprécipitation) ainsi que des outils visant à démonter l'implication du protéasome dans le devenir des facteurs cibles. La partie (2) est basée sur la co-immunoprécipitation de complexes P0-facteurs celllulaires, à partir de plantes transgéniques exprimant la protéine P0 sous une forme étiquetée et mutée (non fonctionnelle sur le plan du protéasome pour ne pas dégrader le/les facteurs cibles). Cette approche a nécessité la mise au point de conditions d'expression de la protéine P0 dans des plantes d'Arabidopsis thaliana soit de manière inductible, soit de manière phloème spécifique (son expression constitutive dans tous les types cellulaires étant létal pour le développement de la plante). Les facteurs associés à la protéine P0 seront ensuite soumis à une analyse par spectrométrie de masse LC-MS/MS. L'interaction potentielle sera ensuite validée par des tests classiques d'interaction mais également par une étude de co-localisation sub-cellulaire et tissulaire. Enfin, des plantes knock-out pour les gènes candidats (ou silencées de manière inductible) seront évaluées pour leur susceptibilité à l'infection par les polerovirus. Cette orientation du projet (partie 2) est essentielle car elle pourrait aboutir à l'identification de nouveaux intermédiaires de la voie du PTGS. Le deuxième axe de recherche s'intéresse au lien potentiel existant entre la restriction au phloème des polerovirus et le RNA silencing. Grâce à la construction d'un polerovirus modifié pour exprimer la protéine GFP, il sera possible de suivre de manière spatio-temporelle la progression de l'infection. Cet outil sera mis à profit pour étudier le développement de l'infection dans des plantes transgéniques exprima