– TransfoBact

La transformation naturelle bactérienne est un processus de transfert génétique qui requiert généralement le développement de la compétence, un état physiologique transitoire. Elle s'effectue via la capture d'ADN exogène, son internalisation et son intégration dans le génome par recombinaison homologue. La transformation génétique est largement répandue chez les bactéries. A ce jour, elle a été mise en évidence chez une cinquantaine d'espèces appartenant à différents groupes taxonomiques (y compris des Archaea). A la différence de la transduction et de la conjugaison, la transformation est un processus inhérent à l'espèce, indépendant d'éléments extrachromosomiques, et peut donc être légitimement considérée comme le seul vrai mécanisme d'échange génétiquement programmé des bactéries. Elle est d'ailleurs regardée comme une forme de parasexualité chez les bactéries. La bactérie pathogène de l'homme Streptococcus pneumoniae est, avec la bactérie du sol Bacillus subtilis, l'un des deux modèles dont la régulation de la compétence et la machinerie de transformation sont les mieux caractérisées. Lors de la compétence, un complexe multiprotéique associé à la membrane est assemblé pour internaliser l'ADN sous forme simple-brin (ADNsb), l'autre brin étant simultanément dégradé par EndA, une nucléase constitutive de S. pneumoniae recrutée par le complexe d'entrée de l'ADN. L'ADNsb internalisé est ensuite soit dégradé par une ou plusieurs nucléase(s) non identifiée(s) [désignée(s) sous le nom générique DegN ], soit pris en charge par l'ADN processome (dont font partie les protéines DprA et RecA) qui le protège de l'action de DegN et l'intègre par recombinaison homologue. Sur la base de ces données, nous proposons que la transformation génétique résulte du fonctionnement intégré de machines multiprotéiques définissant un ADN transformasome. Notre projet vise à identifier ses composants, à explorer le couplage fonctionnel entre machinerie de transport de l'ADN et processome, et à caractériser les différentes étapes de son fonctionnement chez S. pneumoniae. Ce but sera atteint grâce à la collaboration de deux équipes (partenaires du projet) au savoir-faire complémentaire dans les domaines de la génétique, de la biologie moléculaire et de la biochimie, ainsi qu'au travers de collaborations (externes au projet) dans le domaine de la biologie cellulaire et de la bioinformatique. Une combinaison d'approches sera utilisée : i) un réseau d'interactions protéiques construit par la méthode du double-hybride chez la levure sera complété en mettant en ?uvre une méthode complémentaire de mise en évidence d'interactions ''protéine-protéine'', la capture chez S. pneumoniae de complexes multiprotéiques par affinité (suivie d'une identification par spectrométrie de masse). Ce réseau d'interactions devrait permettre de mieux caractériser le processome et le transformasome, et identifier de nouveaux composants ; ii) la localisation subcellulaire de plusieurs protéines du transformasome sera déterminée à différentes étapes de la compétence et de la transformation, à la fois pour caractériser les aspects dynamiques du fonctionnement du processome et pour préciser le rôle de certaines de ses composantes ; iii) les activités individuelles et combinées des protéines DprA, RecA, CoiA et des protéines paralogues, SsbA et SsbB seront étudiées in vitro, et les complexes protéine-ADN analysés par microscopie électronique ; iv) le complexe nucléoprotéique formé précocément à la suite de l'internalisation d'ADN exogène sera extrait de cellules transformées (sauvage ou mutantes, dépourvues de certains éléments du processome) et analysé à l'aide d'anticorps spécifiques de composants du processome (déjà disponibles) ou par spectrométrie de mass