Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour des ARN interférents et des microARN – Vecteur shRNA

Des études récentes ont montré que les petits ARN double brin de 21-23 pb appelés ARN interférents (siRNA) activent un système cellulaire qui induit une destruction sélective des ARN ayant une séquence exactement complémentaire. Les microARN (miRNA) sont des petits ARN codés par les génomes et qui inhibent spécifiquement la traduction des ARNm en formant des hybrides imparfaits avec la région 3'UTR. Les miRNA exercent par ailleurs un effet de type siRNA lorsqu'ils forment des hybrides parfaits avec leurs ARNm cibles. Les siRNA et miRNA regroupés sous le nom de petits ARN formant des boucles en épingles à cheveux (shRNA) peuvent donc être exploités pour inhiber spécifiquement l'expression de gènes cellulaires ou viraux au niveau de leurs ARNm. Ces propriétés des shRNA sont exploitées de manière systématique chez des invertébrés modèles ainsi que chez les végétaux pour étudier les fonctions des gènes et pour créer des lignées de plantes résistantes à des virus. Ces opérations globalement appelées knockdown par analogie avec le knockout des gènes ne peuvent devenir effectives chez les animaux transgéniques que si les gènes codant pour les shRNA sont exprimés de manière appropriée à l'état de transgènes. En effet, les vecteurs existants permettant l'expression des shRNA sont basés sur l'action de promoteurs de type RNA polymerase III qui sont actifs dans des cellules transfectées ainsi que dans des clones cellulaires stables mais non chez les animaux vertébrés transgéniques. D'autre part, l'introduction de tels vecteurs dans des lentivirus ne permet pas un contrôle tissulaire de leur expression. L'utilisation de longs ARNs double brin induit par ailleurs des interférons cytotoxiques.
Ce projet se propose de définir des vecteurs permettant une expression fiable et contrôlée des gènes codant pour des shRNA (siRNA et miRNA) chez les animaux transgéniques. Les modèles utilisés pour cette étude sont des cellules en culture ainsi que des souris et des lapins transgéniques. Les gènes ciblés sont 1°) le gène Prnp allèle VRQ du mouton impliqué dans la survenue de scrapie ; 2°) le gène IE du virus responsable de la maladie d'Aujeszky chez le porc ; 3°) le génome du virus de la septicémie hémorragique du lapin (RHDV). Des siRNA capables d'inhiber leurs gènes cibles ont été définis dans les 3 laboratoires à l'aide de cellules transfectées par des vecteurs contenant des promoteurs de type RNA polymerase III. La transposition aux animaux transgéniques dépend donc de la mise au point de vecteurs d'expression appropriés.