L'effet de la phosphorylation sur l'interaction Tau-tubuline : analyses structurales et fonctionnelles – TAU & TUBULINE

Dans les cellules eucaryotes, le cytosquelette de microtubules est impliqué dans des fonctions aussi diverses que le transport intracellulaire ou la ségrégation des chromosomes lors de la mitose. Pour assurer ces fonctions, le réseau de microtubules se réarrange continuellement, sous le contrôle de protéines endogènes. Dans les neurones, une partie substantielle des microtubules est stabilisée, en particulier sous l'influence de la phosphoprotéine Tau et d'autres MAPs.La phosphorylation de Tau a un rôle physiologique puisqu'elle module la fonction stabilisatrice de Tau, et un rôle pathologique, puisque Tau est hyperphosphorylée dans les agrégats isolés du cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer.De multiples kinases phosphorylent des Serines ou Thréonines de Tau, mais l'effet des différentes phosphorylations reste mal connu. Le manque total de données structurales sur le complexe Tau-tubuline empêche toute rationalisation du 'code barre' subtil associé aux phosphorylations multiples de Tau. Notre projet vise à décrire structuralement l'effet de la phosphorylation de Tau sur sa fonction physiologique. Il comporte trois parties étroitement reliées. Premièrement, nous évaluerons par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) en solution la phosphorylation in vitro de Tau par différentes kinases. La RMN permet de répondre simultanément à la question qualitative (quels sites sont phosphorylés ?) et quantitative (jusqu'à quelle hauteur ?). En utilisant des enzymes recombinantes et la RMN comme outil analytique, nous produirons des échantillons caractérisés au niveau moléculaire. Ceux-là seront évalués pour leur capacité à stabiliser les microtubules, grâce à la fluorescence, la microscopie électronique et la vidéomicroscopie.Deuxièmement, nous combinerons RMN et diffraction des rayons X pour obtenir des données structurales sur le complexe Tau-tubuline et interpréter en termes atomiques les effets de la phosphorylation de Tau. Un obstacle majeur à l'étude structurale de la tubuline par cristallographie est son instabilité intrinsèque et sa polydispersité. Sur la base de nos travaux antérieurs, nous proposons d'y remédier en stabilisant la tubuline par des domaines protéiques du type de celui de la stathmine. Nous avons vérifié que le complexe ternaire domaine stathmine-tubuline-Tau se forme effectivement. La RMN permet de déterminer avec précision le fragment de Tau qui interagit avec la tubuline dans ce complexe. Ce système offre donc une possibilité réelle de déterminer la structure d'un complexe Tau-tubuline. Dans la troisième partie du projet, nous validerons ces données dans un contexte cellulaire. Nous analyserons le comportement de cellules de neuroblastomes humaines transfectés avec des variants de Tau mutés aux sites de phosphorylation clés que nous aurons identifiés. Nous analyserons deux phénotypes particuliers : la croissance neuritique et le pourcentage de Tau dans la fraction microtubulaire de cellules en prolifération.