Contrôle de la polymérisation d'actine par des peptides exogènes: du moléculaire à l'in vivo. – ActinePol

En regard de l'importance de la dynamique et de l'état de polymérisation de l'actine dans les processus physiopathologiques (myopathie, syndrome néphrotique, invasion tumorale ...), nous souhaitons : i) cribler des peptides capables d'entraîner la polymérisation d'actine dans des lysats cellulaires, sur cellules entières et sur un modèle animal de phénotype cancéreux; ii) déterminer, outre l'actine, les protéines partenaires d'interaction de ces peptides; iii) identifier les domaines d'interaction de ces peptides sur l'actine. La polymérisation de l'actine cellulaire, processus dynamique in vivo, est régulée positivement ou négativement par un grand nombre de protéines. Ces protéines ont en commun des domaines d'interaction, caractérisés par des études structurales (RX et / ou RMN) actuellement en émergence, organisés en courtes hélices a à caractère plus ou moins amphiphile et qui ciblent l'actine au niveau d'une crevasse hydrophobe formée entre les sous-domaines 1 et 3 de celle-ci. En regard de ces informations structurales, des premières études menées avec la protéine Vpr de VIH-1, dont certains domaines sont organisés en hélice alpha, ont montré une capacité du domaine (55-75) à rétablir un réseau d'actine dans des fibroblastes tumorigènes 3T3 (zyxine(-)) ainsi que dans des lysats cellulaires (anisotropie de fluorescence liée au passage de l'actine G porteur d'un fluorophore à l'actine F). Un premier criblage de quelques autres peptides a permis d'identifier un second peptide (peptide 133, séquence confidentielle) qui provoque les mêmes effets que le domaine (55-75) de Vpr. - Pour ces deux peptides, nous allons maintenant déterminer les protéines-cibles intracellulaires. En effet, ces premiers peptides conçus et criblés ont effectivement un rôle pro-polymérisant sur l'actine mais, à ce jour, rien ne prouve que cet effet découle de leur interaction directe avec l'actine. Cet effet, direct ou indirect, sera validé par RMN et par une approche protéomique. Les peptides retenus pour leur capacité à influencer la polymérisation de l'actine seront étudiés par RMN, en particulier pour leur potentialité à entrer en compétition sur l'actine avec la thymosine beta-4. En parallèle, des expériences de pontage covalent seront réalisées entre les partenaires d'interaction et l'identité des protéines recrutées, ainsi que les zones d'interaction, seront déterminées par spectrométrie de masse. La stratégie générale suivante sera appliquée: i) conception et synthèse de peptides organisés en hélice alpha; ii) test de polymérisation sur lysats cellulaires, de restructuration du réseau sur cellules (fibroblastes 3T3-EF tumorigènes), de réversion du phénotype cancéreux sur modèle animal; iii) mise en évidence de l'interaction directe ou indirecte de ces peptides avec l'actine : étude par RMN des peptides et de leur interaction avec l'actine, pontage covalent entre les partenaires analysé par spectrométrie de masse. -