Analyse des réseaux de kinases par génétique chimique – Analyse des rés

Avec la publication de nombreux génomes, d'importantes recherches sont nécessaires afin de disséquer et d'étudier la fonction des nombreux gènes, ainsi que celle des protéines correspondantes. Sur le plan génomique, le profilage d'expression d'ARNm s'est avéré être un outil puissant pour répondre à ces questions. Il est important de noter que la fonction des protéines est souvent régulée de manière post-traductionnelle. Ainsi, une méthode permettant de mesurer la fonctionnalité ou l'activité spécifique de ces protéines, plutôt que le niveau d'expression de celles-ci ou leur quantité, parait de première priorité. Par la suite, il est aussi important de pouvoir moduler la fonction de ces protéines afin d'établir une relation de cause à effet entre un profil d'activité enzymatique et un phénotype. En parallèle à la génétique classique où la fonction d'un gène ou du produit de ce gène est déduite par un « knock-out » de ce gène, le criblage de chimiothèques de petites molécules est à l'origine d'efforts récents visant à établir une approche systématique pour étudier la fonction de protéine. Cette approche appelée « chimie génétique » a deux atouts importants. Premièrement, un inhibiteur a le potentielle de discriminer parmi plusieurs fonctions dans une protéine multifonctionnelle; deuxièmement, les inhibiteurs permettent de moduler la fonction d'une protéine de façon réversible avec un contrôle temporel, ce qui est essentiel pour étudier des protéines nécessaires à la survie d'une cellule. - Le projet proposé aborde ces questions pour une classe d'enzyme importante, les kinases, pour lesquelles il est bien connu que la fonction est contrôlée au niveau post-traductionnelle. L'annotation du génome humain prédit plus de 500 kinases. Nous proposons de développer des micropuces de substrats pour définir la spécificité d'une kinase et de mesurer l'activité de kinases à l'échelle protéomique à partir de lysat brut. Nous avons démontré que nous pouvons préparer des puces de petites molécules à partir de puce ADN en étiquetant chaque molécule avec un PNA (peptide nucléique acide). Cette étiquette a deux rôles: premièrement elle encode l'histoire synthétique et donc la structure de chaque composé dans une chimiothèque combinatoire synthétisée par la méthode « split and pool » et deuxièmement, elle localise chaque composé d'une chimiothèque à une adresse prédéfinie lors d'une hybridation sur une puce ADN. Afin de développer des chimiothèques visant les kinases, nous proposons de nous baser sur une famille de substances naturelles (les macrolide du résorcinol) qui comprend 4 inhibiteurs de kinases parmi les 28 membres naturels. Ces chimiothèques seront préparées par chimie combinatoire traditionnelle et par chimie combinatoire encodée par les PNA. Cette dernière méthode est particulièrement intéressante car elle nous permet de cribler les chimiothèques de petites molécules directement contre des lysats brut contenant l'ensemble des kinases présentes. -