Asymétrie lipidique des bicouches membranaires: mécanisme moléculaire du transport de lipides et rôle de ce transport dans le trafic membranaire – AsymLip

La dissection du mécanisme catalytique de la flippase de levure Drs2p/Cdc50p implique l’expression du complexe dans S. cerevisiae, sa solubilisation ainsi que sa purification et sa reconstitution en protéoliposomes. Une fois cette procédure optimisée, nous pourrons identifier, par mutagenèse dirigée, les régions cruciales pour le transport de lipides et/ou l’activité de la flippase.
Nous tirerons partie du fait que les ATPases de type P forment un dérivé phosphorylé stable pour étudier les réactions partielles du cycle catalytique, grâce à des expériences de marquage par l’ATP radioactif. Nous pouvons également d’ores et déjà étudier l’activité ATPasique de la flippase en détail (par exemple son affinité pour l’ATP, sa dépendance en pH ou pour des lipides spécifiques). Lorsque le complexe aura été reconstitué en protéoliposomes, nous mettrons au point un test de transport de phospholipides marqués par un groupement NBD fluorescent.
La caractérisation structurale du complexe Drs2p/Cdc50p implique la purification à grande échelle de différentes constructions, des tests de cristallisation ainsi que la résolution de sa structure tridimensionnelle. Pour ce faire, le complexe est purifié par chromatographie d’affinité sur billes de streptavidine puis passé sur chromatographie d’exclusion de taille.
Pour établir un lien entre transport de lipides par les ATPases P4 et la biogenèse de vésicules membranaires, des vésicules géantes (GUVs) seront générées par électroformation à partir de protéoliposomes classiques. Les éventuelles déformations membranaires associées au transport de lipides seront observées par microscopie optique. En raison du caractère potentiellement délétère de l’électroformation sur l’activité de Drs2p/Cdc50p, nous pourrions avoir recours à un protocole récemment décrit qui permet de ne pas faire subir d’électroformation à la protéine reconstituée. Une fois les complexes reconstitués en GUVs, le transport de lipides sera déclenché par l’addition d’ATP.

Au cours des 30 premiers mois du projet, nous avons mis au point l’expression et la purification fonctionnelle de Drs2p, en association avec la sous-unité non catalytique Cdc50p. Nous avons démontré que le PI4P, un phosphoinositide clé dans la régulation du trafic membranaire, est essentiel à l’activation du complexe purifié. Sur la base d’expériences préliminaires suggérant un rôle d’un domaine de Drs2p dans la régulation de son activité, nous avons adopté une approche par protéolyse ménagée pour étudier plus précisément ce mécanisme de régulation. La protéolyse ménagée permet de cliver le domaine régulateur et d’activer le complexe Drs2p/Cdc50p d’un facteur 30 à 50, démontrant le rôle de ce domaine dans l’autoinhibition du transporteur. De façon remarquable, cette activité reste sensible au PI4P, suggérant un mode d’activation du complexe en deux étapes.
Nous avons également progressé sur le front de la caractérisation structurale du complexe Drs2p/Cdc50p. Les quantités que nous sommes en mesure de purifier ont permis à nos collaborateurs au Danemark d’effectuer des tests de cristallisation. En parallèle, nos collaborateurs développent l’étude du complexe par cryo-microscopie électronique en particule unique. Le complexe peut être soit manipulé en détergent, soit reconstitué en nanodisques, et l’analyse par microscopie électronique montre un échantillon homogène adapté à une étude structurale par cryo-microscopie électronique.
Nous avons également cloné le gène ATP8B1, ainsi que les sous-unités associées CDC50A et CDC50B. Les constructions dont nous disposons à l’heure actuelle nous permettent d’exprimer ATP8B1 en absence ou en présence de CDC50A ou CDC50B, grâce à la fabrication d’un vecteur permettant la co-expression de deux protéines. ATP8B1 est exprimée dans les membranes de levures, et des résultats préliminaires suggèrent qu’elle y interagit avec CDC50A.

Maintenant que nous disposons du complexe Drs2p/Cdc50p sous forme pure, fonctionnelle, et stable, nous pouvons envisager sa caractérisation fonctionnelle détaillée. Nous avons d’ailleurs déjà débuté cette caractérisation du mécanisme de transport des lipides, et plus particulièrement sa régulation, comme en témoignent nos données obtenues après protéolyse ménagée. Il est à présent essentiel de mettre au point un test de transport de phospholipides fluorescents, après reconstitution du complexe purifié en protéoliposomes. Ceci nous permettra de disposer d’un test fonctionnel supplémentaire, essentiel dans la perspective de la reconstitution du complexe en GUVs. Au-delà de fournir un moyen d’identifier des déformations membranaires associées au transport de lipides par une flippase purifiée, la reconstitution en GUVs devrait également permettre de fournir un test de transport de lipides naturels, et non modifiés par un groupement fluorescent.
L’identification de régions désordonnées de Drs2p facilement accessibles aux protéases (voir nos résultats de protéolyse ménagée) est également prometteuse dans la perspective de la cristallisation de Drs2p/Cdc50p. En effet, ces régions désordonnées sont néfastes pour la formation du réseau cristallin et nous pouvons donc maintenant utiliser le complexe débarrassé de ces domaines non structurés pour essayer d’améliorer la cristallisation.
Parallèlement à ces études sur la flippase de levure Drs2/Cdc50, nous avons démarré l’étude du transporteur ATP8B1, co-exprimé avec CDC50A ou CDC50B. Nous allons maintenant examiner la fonction du transporteur humain exprimé dans les membranes de levures, en tirant profit de la capacité des ATPases de type P à s’autophosphoryler. Si la protéine exprimée s’avère active, nous pourrons alors débuter sa caractérisation fonctionnelle détaillée et étudier l’impact des mutations d’ATP8B1 trouvées chez les patients atteints de cholestase intrahépatique.

Azouaoui H, Montigny C, Dieudonné T, Champeil P, Jacquot A, Vázquez-Ibar JL, Le Maréchal P, Ulstrup J, Ash MR, Lyons JA, Nissen P, Lenoir G (2017) High phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P)-dependent ATPase activity for the Drs2p-Cdc50p flippase after removal of its N- and C-terminal extensions. J Biol Chem, 292:7954-7970

Montigny C, Dieudonné T, Orlowski S, Vázquez-Ibar JL, Gauron C, Georgin D, Lund S, le Maire M, Møller JV, Champeil P, Lenoir G (2017) Slow phospholipid exchange between a detergent-solubilized membrane protein and lipid-detergent mixed micelles: brominated phospholipids as tools to follow its kinetics. PLoS One. 12:e0170481

Montigny C, Lyons J, Champeil P, Nissen P, Lenoir G. (2016) On the molecular mechanism of flippase- and scramblase-mediated phospholipid transport. Biochim Biophys Acta, 1861:767-83.

Azouaoui H, Montigny C, Jacquot A, Barry R, Champeil P, Lenoir G (2016) Coordinated overexpression in yeast of a P4-ATPase and its associated Cdc50 subunit: the case of the Drs2p/Cdc50p lipid flippase complex. Methods Mol Biol. 1377:37-55

Champeil P, Orlowski S, Babin S, Lund S, le Maire M, Møller JV, Lenoir G, Montigny C (2016) A robust method to screen detergents for membrane protein stabilization, revisited. Anal Biochem. 511:31-5

Les lipides membranaires remplissent de nombreuses fonctions cellulaires essentielles et leur répartition asymétrique entre les deux feuillets de certaines des membranes eucaryotes (avec le feuillet cytosolique enrichi en phosphatidylsérine (PS) et phosphatidyléthanolamine (PE) et le feuillet exoplasmique enrichi en sphingolipides) est impliquée dans des processus cellulaires fondamentaux. La dissipation de cette asymétrie, résultant du « flip-flop » des phospholipides, est par ailleurs associée à de nombreux processus (patho)-physiologiques, tels que la reconnaissance par les macrophages des cellules en apoptose ou encore l’activation des cascades réactionnelles de coagulation du sang.
Les membres de la sous-famille P4 des ATPases de type P (ATPases P4) sont à ce jour les meilleurs candidats à l'établissement et au maintien de cette asymétrie (autant que l’on puisse en juger par l’utilisation d’analogues fluorescents de lipides), mais les ATPases P4 sont également impliquées dans la formation de vésicules d’exo/endocytose. En outre, les ATPases P4 interagissent avec les protéines de la famille Cdc50, essentielles pour l’adressage correct des ATPases P4. Le rôle exact des différents partenaires dans le transport des lipides reste néanmoins à établir.
Le projet proposé se situe à l’interface entre biochimie, biologie cellulaire, et biophysique. Il a pour but la caractérisation fonctionnelle et structurale des complexes moléculaires que forment les ATPases P4 et les protéines Cdc50, ainsi que l’élucidation du lien entre le transport des lipides par les ATPases P4, le trafic membranaire, et les pathologies associées. Pour ce faire, nous nous intéresserons dans un premier temps à une ATPase P4 de levure, la protéine Drs2p, et à sa sous-unité associée, Cdc50p ; Drs2p est en effet l’ATPase P4 pour laquelle existent les données les plus convaincantes quant à son implication dans le trafic membranaire et le transport de lipides. Dans un second temps, nous démarrerons l’étude d’un complexe humain, le complexe des protéines ATP8B1 et CDC50A, dont les mutations conduisent à la cholestase intrahépatique. Nous étendrons également notre champ d’investigations à l’étude de flippases du parasite P. falciparum, car ces flippases pourraient constituer des cibles nouvelles pour le traitement de la malaria.
Ces complexes seront surexprimés dans la levure S. cerevisiae. Les membranes isolées constitueront notre matériel de départ pour une étude préliminaire du cycle de transport catalysé par les complexes Drs2p/Cdc50p et ATP8B1/CDC50A, et pour une étude structure/fonction visant à identifier les résidus ou domaines importants pour cette activité. C’est dans ce cadre que nous examinerons notamment les conséquences, sur le fonctionnement d’ATP8B1, des mutations identifiées chez les patients atteints de cholestase intrahépatique. Les complexes ATPase P4/protéine Cdc50 seront également purifiés par chromatographie d’affinité, pour une étude fonctionnelle détaillée du cycle de transport.
Dans le même temps, les complexes purifiés (Drs2p/Cdc50p, ATP8B1/CDC50A, ou les flippases de P. falciparum) seront étudiés par cristallographie aux rayons X, en collaboration avec le laboratoire de P. Nissen à Aarhus, afin de déterminer leur structure à haute résolution, préalable nécessaire à la compréhension du mécanisme moléculaire du transport des lipides et à son contrôle dans des situations pathologiques.
Indépendamment, les complexes purifiés seront reconstitués en vésicules géantes (GUVs), en collaboration avec le laboratoire de J. Holthuis à Osnabrück. Par ce biais, nous souhaitons observer, par microscopie optique, les déformations membranaires associées au transport de lipides naturels d’un feuillet à l’autre des vésicules. En effet, selon l’hypothèse émise par Sheetz & Singer, une faible augmentation de l’aire d’un des deux feuillets par rapport à l’autre doit pouvoir induire une courbure de la membrane et un bourgeonnement vésiculaire.