Nouvelles stratégies de marquage paramagnétique pour l’étude des transitions structurales dans les protéines désordonnées – SPINFOLD

La dynamique des protéines et les transformations structurales qu’elles subissent sont d’un intérêt majeur car elles sont impliquées dans de nombreux processus biologiques essentiels. Ceci est particulièrement crucial dans les Protéines Intrinsèquement Désordonnées qui jouent des rôles très diversifiés mais pour lesquelles les approches structurales classiques restent très limitées. Dans ce projet fortement pluridisciplinaire, quatre équipes regroupant Chimistes, Biologistes et Physiciens ont associé leurs compétences pour mettre au point et tester de nouvelles sondes magnétiques dans l'étude des protéines flexibles par spectroscopie RPE. Trois protéines présentant divers degrés de flexibilité ont été choisies comme modèles : i) le domaine NTAIL de la nucléoprotéine du virus de la rougeole.; ii) la protéine CP12 impliquée dans l’assimilation du CO2 chez les microalgues; iii) NarJ, une chaperonne
impliquée dans la biogenèse d’une métalloenzyme complexe. La synthèse de nouveaux radicaux nitroxydes capables d’être greffée en plusieurs sites
de ces protéines, couplée à des techniques avancées de RPE pulsée ont fourni des informations cruciales aux échelles nanométriques pour la compréhension des transitions structurales dans ces systèmes.

Les résultats majeur du projet sont :
1/ le premier greffage d’une sonde paramagnétique sur un acide aminé autre qu’une cystéine : une tyrosine. Un nitroxyde basé sur un motif
isoindoline a été synthétisé, greffé sélectivement sur la tyrosine d’une protéine modèle et sa capacité à rendre compte de modifications structurales a été démontrée.
2/ la synthèse et la caractérisation d’un nitroxyde phosphorylé permettant la diversification des signatures spectrales, rendant ainsi possible l’étude
des deux sites protéiques simultanément. Ces résultats constituent une avancée majeure pour développer les applications biostructurales de la
RPE. Les nouveaux marqueurs de spin synthétisés dans le projet ont permis de progresser significativement dans la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu dans les processus de reconnaissance et de repliement induit des protéines désordonnées. Parmi les résultats les plus remarquables on peut mentionner :
- Le décryptage du repliement induit du domaine NTAIL (a-more) de la nucléoprotéine des virus de la rougeole (MeV) et de virus pathogènes apparentés (HeV et NiV) lors de son interaction, avec son partenaire XD de la polymérase (PXD)
- La mise en évidence de la formation d’un complexe « flou » dans la régulation de l’enzyme GAPDH du cycle de Calvin d’assimilation du CO2 par la CP12 chez les microalgues. Dans ce complexe, l’extrémité C-ter de la CP12 tout en participant à la zone d’interaction entre les deux protéines, conserve une mobilité très importante à la surface électrostatiquement chargée de la GAPDH.
- La mise en évidence d’un processus de sélection conformationnelle dans l’interaction de la chaperone NarJ avec son site de fixation dans l’étape finale de la biogenèse de la molybdoenzyme membranaire, nitrate réductase bactérienne

- Fiabiliser le greffage de marqueurs paramagnétique sur Tyrosine en optimisant les procédures de greffage.
- Développer des marqueurs de spin possédant des temps de relaxation
électronique longs afin de permettre des mesures de distances intersondes par Double Résonance Electronique (DEER) sur une gamme plus étendue (> 6nm).
- Développer des marqueurs de spin résistant à la bioréduction afin de permettre les approches de RPE biostructurale in cellulo.
- Développer les méthodologies de mesures de distance par DEER entre radicaux nitroxydes et centre métalliques endogènes dans les métalloprotéines.
L’ensemble de ces développements permettra de conforter la RPE biostructurale comme une méthodes d’investigation puissante des propriétés structurales et dynamiques des grands édifices biologiques, complémentaires des approches structurales classiques (RX,
RMN).

La réalisation du projet a donné lieu à une vingtaine de publications dans des revues internationales, un chapitre de livre, et une cinquantaine de
communications en congrès. La majorité associe 2 ou 3 partenaires du consortium, démontrant une synergie forte des équipes où l’association des expertises multidisciplinaires a été cruciale pour la réussite du projet. Les nouvelles sondes et les avancées méthodologiques nous positionnent
comme leader en RPE biostructurale et plusieurs nouvelles collaborations ont été initiées.

L?étude des changements conformationnels des protéines est d?un intérêt crucial car ces transformations sont impliquées dans de nombreux processus biologiques tels que la régulation de l?activité enzymatique, la reconnaissance et l?assemblage moléculaires. Ces transitions structurales sont particulièrement importantes dans les Protéines Intrinsèquement Désordonnées (IDP) qui, tout en étant dépourvues de structure secondaire et tertiaire stables en conditions physiologiques, remplissent des fonctions essentielles. L?intérêt fonctionnel du désordre est associé à une grande plasticité permettant l?interaction avec plusieurs partenaires. La plupart des IDP adopte une conformation bien définie lors de l?interaction avec leur partenaire cible. Cette transition désordre-ordre, nommée « repliement induit », est étroitement reliée à la fonction de la protéine. Le suivi de ces processus de repliement est donc essentiel pour comprendre le rôle fonctionnel des régions non-structurées. Cependant, du fait de la flexibilité protéique même, ces transitions structurales ne peuvent être abordées de manière satisfaisante par les techniques conventionnelles, telle la Cristallographie aux rayons X et la RMN. D?autres méthodes spectroscopiques peuvent être utilisée comme le Dichroïsme Circulaire et la diffusion des rayons X aux petits angles, mais elles n?apportent qu?une information globale sur la structure protéique. En revanche, l?utilisation de sondes paramagnétiques combinée à la spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) est une technique bien adaptée à l?étude des changements conformationnels dans les systèmes hautement flexibles. De plus, elle n'est pas limitée par la taille des protéines et n'en nécessite que de faibles quantités. Cette approche repose sur l'insertion d'une sonde paramagnétique en un site prédéfini d'une protéine, généralement une cystéine pré-existante ou introduite par mutagenèse dirigée, suivie par l?étude de sa mobilité par RPE. Les marqueurs habituellement utilisés sont des radicaux nitroxyde, mais la faible diversité de marqueurs commerciaux et l?implication fréquente des cystéines dans la fonction biologique limitent fortement cette approche. A ce jour, peu de tentatives ont été réalisées pour étendre les potentialités des sondes radicalaires, et toutes sont dépendantes d?un greffage sur cystéine. L?objectif de ce projet est de développer de nouvelles sondes paramagnétiques permettant le suivi des transitions structurales dans des systèmes protéiques désordonnés ou dotés d?une grande flexibilité. Dans ce but, 4 équipes mettent en commun leurs compétences complémentaires dans un projet fortement multidisciplinaire, regroupant chimistes, biochimistes, biologistes moléculaires et physiciens. En particulier, nous synthétiserons des sondes paramagnétiques originales contenant d'autres noyaux magnétiques (31P, 15N) afin de diversifier les signatures spectrales des marqueurs de spin. D?autre part, nous développerons de nouvelles stratégies pour lier de façon covalente ces sondes à des amino-acides autres que les cystéines. Ceci permettra la fixation de sondes différentes sur une même protéine ou sur deux protéines partenaires. Grâce à leurs signatures spectrales différentes, l'environnement local de chaque sonde pourra être suivi indépendamment dans les processus d?interaction protéine-protéine et de repliement induit. Ces changements structuraux seront étudiés par RPE, d?une part à travers la mesure de paramètres tels que la mobilité du marqueur et son accessibilité au solvant, et d?autre part à travers les mesures de distances inter-sondes par RPE pulsée. Le projet ciblera spécifiquement les Tyrosine et Tryptophane comme site de greffage. Ces résidus hydrophobes et encombrants sont présents en faible proportion dans les IDP, ce qui constitue un avantage essentiel pour réaliser un marquage spécifique. Plusieurs stratégies de synthèse et de fonctionnalisation des marqueurs de spin seront développées afin d?optimiser le rendement et la sélectivité du marquage sur ce type de résidu. Ceci sera facilité par le grand domaine de stabilité des IDP en température et en pH, ce qui permettra de diversifier les conditions expérimentales explorées pour optimiser le greffage Ces nouvelles sondes seront utilisées pour l'étude des transitions structurales induites dans trois protéines modèles présentant divers degrés de flexibilité. Toutes ont en commun un caractère multi-fonctionnel illustré par leur capacité à interagir avec différents partenaires. Ces trois protéines modèles sont : i) un domaine protéique intrinsèquement désordonnée (domaine NTAIL de la nucléoprotéine du virus de la rougeole); ii) une protéine partiellement désordonnée (CP12, protéine impliquée dans l?assimilation du CO2); iii) une protéine structurée mais présentant néanmoins plusieurs régions flexibles (NarJ, une chaperone impliquée dans la biogenèse d?une métalloenzyme complexe : la nitrate réductase membranaire).