– PAMM

La microscopie non-linéaire à balayage laser (NL-LSM) est la technique de choix pour obtenir une résolution sub-cellulaire en profondeur dans des tissus biologiques diffusants. La caractéristique principale de la NL-LSM est de réaliser en profondeur dans un tissu une excitation intrinsèquement ponctuelle, limitée par la diffraction. Il n'est donc pas nécessaire de reformer une image ou de sélectionner les photons par un trou d'épingle pour pouvoir mesurer les propriétés d'un voxel. Par ailleurs il est possible de photostimuler ce voxel sélectivement. Cette capacité d'accès ponctuel n'est que partiellement exploitée dans les microscopes actuels qui restent tournés vers l'imagerie au sens strict. En effet les contraintes inertielles des systèmes de balayage mécaniques utilisés classiquement imposent d'effectuer des balayages sous forme d'images 2D ou de lignes, limitant donc considérablement le rendement et la gamme dynamique des applications potentielles de la NL-LSM. Il serait intéressant de pouvoir adresser optiquement et à grande vitesse des voxels individuels choisis, sans reconstituer une image, tant pour mesurer leurs propriétés que pour modifier ces propriétés par photoactivation. Nous proposons d'affranchir la NL-LSM des contraintes spatiotemporelles du balayage mécanique dans les trois dimensions de l'espace en combinant des déflecteurs acousto-optiques (AOD) et des systèmes électro-optiques pour réaliser balayage et focalisation. La nouveauté de ce microscope serait la possibilité d'adresser n'importe quel voxel d'un volume d'observation en quelques microsecondes. Depuis deux ans les équipes de S. Dieudonné et de L. Bourdieu ont combiné leurs expertises en biologie et en physique pour proposer des solutions originales aux difficultés techniques liées à l'utilisation des AOD en microscopie non-linéaire. Deux premiers microscopes biphotoniques pleinement interfacés utilisant des AOD ont ainsi été construits. Ce nouveau projet a pu voir le jour grâce à l'engagement de la société Fastlite, dont le coeur d'expertise est la mise en forme des impulsions lasers, et qui s'est investie dans la conception de lentilles électro-optiques. Nous profiterons également du soutien de la société A-A, un leader mondial dans les systèmes acousto-optiques. Les deux sociétés faisant partie du pôle R&D en optique de la région Ile-de-France, la collaboration sera facilitée. Nous proposons de construire un prototype réalisant des balayages 3D ultra-rapides avec des pulses laser sub-100fs dans des grands champs d'observation. Pour arriver à ce résultat, deux développements techniques seront entrepris : (i) Nous réaliserons à l'aide des lentilles électro-optiques la pré-compensation spatiale et temporelle complète des distorsions subies par les pulses lasers dans les AODs par des méthodes novatrices. Nous obtiendrons des champs de 300µm, avec des pulses de 100fs au point focal et une résolution limitée par la diffraction. Ceci permettra de conserver l'efficacité d'excitation non-linéaire au point focal tout en bénéficiant de la vitesse d'accès des AOD, ce qui est essentiel pour toutes les application requerrant une forte excitation pendant des temps courts (décageage, photoactivation) (ii) L'introduction de lentilles cylindriques électro-optiques de focale ajustable à une échelle de temps identique à celle des AOD permettra par ailleurs un adressage tridimensionnel rapide et des balayages ultrarapides (100µs à 1ms par ligne). Les applications de cette microscopie non-linéaire d'adressage ponctuel rapide sont multiples. Nous avons montré (article en préparation) qu'il est possible d'effectuer une cartographie fonctionnelle des dendrites et des épines de la cellule de Purkinje à une cadence de l'ordre du kHz. Par ailleurs la sensibilité de cette technique rend possible pour la première fois l'enregistrement multiunitaire optique continu à 1 kHz pendant 30 min sans phototoxicité. L'enregistrement multiunitaire optique résolu en temps pourrait repr