Caractérisation de la signalisation cGLR-STING dans l'immunité antivirale chez la drosophile – ROXANNE2

Le travail a été réalisé par un chercheur post-doctoral financé dans le cadre du projet, ainsi que quatre doctorants, avec l'aide d'un ingénieur de recherche CNRS. Les analyses d'imagerie ont été faites à la pateforme de l'Institut de Biologie Moléculaire des Plantes à Strasbourg; l'interactome de STING a été réalisé à la plateforme de protéomique de l'Esplananade, hébergée à l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IBMC) à Strasbourg; les études de chromatographie-liquide couplée à la spectrométrie de masse pour détecter les dinucléotides cycliques ont été réalisées à l'Institut d'Ingénierie Supramoléculaire de Strasbourg; les expériences d'infection de drosophile ont été réalisées au sein de l'insectarium de l'IBMC.

Le projet Roxanne 2 a atteint la plupart de ses objectifs. En ce qui concerne l'axe 1, nous avons pu établir la preuve génétique que cGLR1 et cGLR2 étaient impliqués dans la production de dinucléotides cycliques in vivo en réponse aux infections virales. Nous avons en particulier montré que cGLR1 et cGLR2 produisaient, en plus du 2'3'-cGAMP et du 3'2'-cGAMP, un nouveau dinucléotide cyclique, le 2'3'-c-diGMP. La fonction de cGLR3 reste cependant encore mystérieuse. Pour l'axe 2, nous avons pu en collaboration avec l'équipe de Philip Kranzusch à l'université Harvard aux USA montrer que des versions recombinantes de la protéine cGLR2 de Drosophila pseudoananassae et D. bipectinata produisaient du 2'3'c-diGMP lorsqu'elles étaient incubées in vitro avec de l'ARN double brin. Nous avons également montré que cGLR1 et cGLR2 sont localisés dans des compartiments cellulaires différents, cGLR1 étant localisé dans le cytosol alors que cGLR2 est concentré dans le noyau. Nous avons identifié et validé expérimentalement l'existence d'un signal de localisation nucléaire (NLS) et d'un signal d'export nucléaire (NES) dans cGLR2. En outre, nous avons montré dans des cellules transfectées et in vivo dans des mouches transgéniques qu'une version de cGLR2 muté dans son NLS était toujours capable d'activer la signalisation STING, alors qu'une version de cGLR2 muté dans son NES est inactive. Ce résultat indique que cGLR2 doit être localisé dans le cytosol pour activer l'immunité antivirale (manuscrit en préparation).

Dans le contexte de l'axe 3, nous avons montré que les dinuléotides cycliques étaient impliqués dans une réponse systémique aux infections virales et jouent un rôle clé d'immuno-transmetteur entre les cellules infectées et certains organes comme le système nerveux central, l'intestin, le système excréteur et les voies génitales. Nous avons exploité cette propriété et le fait que les cellules de drosophile peuvent efficacement importer les dinucléotides cycliques pour tester leur capacité à induire l'immunité antivirale dans 10 espèces de drosophiles, couvrant 40 millions d'années d'évolution: ceci nous a permis d'identifier de nouveaux gènes antiviraux, certains conservés chez une majorité d'espèces et d'autres spécifiques d'une ou de quelques espèces. Nous avons également caractérisé la voie STING et son implication dans le contrôle des infections virales chez les abeilles, et montré que la réponse induite était persistante (deux articles en révision).

Finalement, nous avons identifié un mécanisme impliquant l'adaptateur FADD et DREDD, l'homologue de la caspase-8, dans l'activation du facteur de transcription Relish par STING. Nous confirmons dans cette étude que Relish est régulé par deux voies de signalisation, IMD et STING, qui recrutent par des mécanismes indépendants le complexe FADD-DREDD pour activer Relish.

Le projet a ouvert trois perspectives principales, qui font à présent l'objet des travaux de l'équipe:

(i) caractérisation des transporteurs impliquées dans l'export et l'import des dinucléotides cycliques chez la drosophile; nous avons réalisé des cribles qui nous ont permis d'identifier 4 candidats pour l'export et 3 pour l'import. Certains de ces candidats font partie de familles qui n'ont jusqu'ici pas été impliquées dans le transport de dinucléotides chez les mammifères.

(ii) caractérisation du mécanisme recrutant Relish vers les promoteurs de gènes régulés par STING plutôt que vers ceux des promoteurs de gènes codant les peptides antimicrobiens dans le contexte d'infections virales; nous avons identifié un cofacteur de Relish qui est essentiel pour l'activation de la voie STING et l'immunité antivirale mais n'a pas d'impact sur la voie IMD et l'immunité antibactérienne.

(iii) exploitation de la voie STING pour découvrir parmi les gènes régulés par STING chez de nombreuses espèces d'insectes ou d'arthropodes (notamment tiques) de nouveaux facteurs antiviraux.

Dans le cadre du projet ROXANNE (2017-2021) financé par l'ANR, nous avons caractérisé une nouvelle voie de l’immunité innée fonctionnant dans le contrôle des infections virales chez l'organisme modèle drosophile. Cette voie implique la molécule STING conservée au cours de l'évolution, qui active un programme transcriptionnel dépendant d’un facteur de transcription NF-kB, Relish, et médie la résistance aux infections virales. Nous avons récemment identifié deux récepteurs cGAS-like (cGLR) impliqués dans l'activation de cette voie, via la production de trois dinucléotides cycliques (CDN), 2'3'-cGAMP, 3'2'-cGAMP et 2'3'- c-di-AMP. Le but de ce projet est de répondre aux nouvelles questions soulevées par cette découverte. Nous étudierons la fonction précise des cGLR in vivo, en déterminant les tissus dans lesquels ils sont actifs, le compartiment cellulaire où ils opèrent et comment ils intègrent leur activité avec la voie des petits ARN interférents (si), que l'on croyait jusqu'à présent être le principal mécanisme antiviral chez les mouches. En particulier, nous tenterons d'identifier le ligand activant cGLR2 et le mécanisme par lequel le récepteur est activé. Dans un deuxième objectif, nous étudierons la fonction des trois CDN, en abordant leur rôle possible en tant qu'immunotransmetteurs dans l'immunité systémique. Enfin, nous aborderons le mécanisme par lequel STING active NF-kB, une question encore mal comprise chez les mammifères et pour laquelle nous avons récemment obtenu des résultats préliminaires prometteurs. Globalement, ce projet de recherche vise à exploiter les ressources du modèle drosophile pour éclaircir des aspects encore mal compris ou émergents de la biologie des facteurs cGAS/STING.