Décrypter les mécanismes impliqués dans l'hyperaccumulation de métaux alcalino-terreux par les cyanobactériesphering the mechanisms involved in the hyperaccumulation of alkaline earth metals by cyanobacteria – HARLEY

Les cyanobactéries sont des organismes photosynthétiques diversifiés et très abondants qui utilisent la lumière pour fixer le CO2 atmosphérique et produire une biomasse considérable qui alimente une grande partie de la chaine alimentaire. Nous avons découvert récemment que certaines cyanobactéries forment des carbonates de calcium amorphes intracellulaires (iACC) et accumulent ainsi de très grandes quantités d’alcalino-terreux (AEEs) comme le Ca, Sr, Ba ou le Ra. Bien que cette accumulation massive intracellulaire interroge sur l’homéostasie particulière des AEEs par ces bactéries et offre des perspectives prometteuses pour remédier les pollutions radioactives en 90Sr et 226Ra, nous en ignorons les mécanismes. Grâce à une approche récente de génomique comparative, nous avons identifié un gène orphelin, nommé ccyA, vraisemblablement impliqué puisqu’il est présent chez toutes les cyanobactéries formant des iACC et absent des autres. Les prédictions bioinformatiques suggèrent que ccyA code une protéine nommée Calcyanine qui contient deux domaines protéiques présentant des similitudes mais aussi des différences claires avec d’autres domaines connus. Le projet Harley vise à déterminer les mécanismes biochimiques de l’accumulation intracellulaire et de l’homéostasie des AEEs chez les cyanobactéries formant des iACC et à comprendre le rôle de la Calcyanine. Il sera mené par un consortium interdisciplinaire regroupant des expertises en biochimie, biologie structurale, biophysique, biogéochimie, génétique et physiologie des cyanobactéries. Nous proposons de (1) caractériser les propriétés structurales et chimiques de la Calcyanine in vitro. La protéine et ses domaines séparés seront purifiés après expression en système hétérologue. Leurs structures seront déterminées par cristallographie des rayons X et cryo-microscopie électronique en transmission (MET). Leurs affinités pour le Ca, le Sr et le Ba seront mesurées et leur impact sur la précipitation des ACC sera analysé. (2) Caractériser la fonction de la Calcyanine in vivo. Nous éliminerons/complémenterons ccyA dans des souches formant des iACC et analyserons en détail le phénotype de toutes ces souches. Parallèlement, nous introduirons ccyA dans des souches modèles pour la génétique et ne formant pas d’iACC. La localisation de la Calcyanine sera déterminée par construction de fusions avec la protéine fluorescente GFP. Les phénotypes des mutants ainsi produits et notamment l’homéostasie des AEEs, seront analysés par des mesures de chimie des solutions, des analyses en MET et microscopie des rayons X à balayage en transmission. De plus, le Ca2+ libre sera mesuré par microscopie confocale à balayage laser dans des souches où nous aurons introduits des gènes rapporteurs du Ca. (3) Rechercher d’autres protéines impliquées dans la formation d’iACC par 3 approches : (i) mutagenèse aléatoire à l’aide de transposons, en discriminant les mutants d’intérêt par la diminution de leur densité cellulaire ; (ii) extraction et identification par spectrométrie de masse des protéines associées aux iACC; (iii) identification de protéines partenaires de la Calcyanine par co-immunoprécipitation. L’annotation structurale et fonctionnelle de ces protéines sera systématiquement entreprise par bioinformatique. En plus de faire progresser les connaissances sur l’homéostasie des AEEs dans ces cyanobactéries et des mécanismes de biominéralisation des iACC, les résultats du projet Harley seront de grand intérêt pour la biologie structurale du fait de la détermination de nouveaux repliements protéiques et de leur fonction ainsi que pour la microbiologie par le développement de nouveaux modèles génétiques manipulables dans les cyanobactéries. A plus long terme, le projet Harley sera aussi crucial pour le développement de nouveaux systèmes biomimétiques ou biosynthétiques pour une bioremédiation efficace de pollutions par les AEEs notamment radioactifs.