Les diatomées sont des organismes très prometteurs pour la production de biocarburants car elles produisent de grandes quantités de lipides en situation de carence nutritive. Nous émettons l'hypothèse que les ARN longs non codants exprimées chez Phaeodactylum tricornutum en réponse à un stress nutritionnel sont susceptibles d'être des acteurs majeurs dans des voies de régulation de la production de biomasse, qui sont corroborées par des données préliminaires.
Le projet est composé de trois objectifs de recherche qui sont interconnectés, complémentaires et reflètent la nature synergique de la collaboration du présent consortium. <br />L'objectif 1 est d'identifier et de caractériser les lincRNA régulateurs de la production de lipides et du cycle cellulaire. D'une part, notre objectif est de trouver les lincRNAs qui servent de checkpoints à la progression du cycle cellulaire sans interférer avec l'accumulation de lipides. L'hypothèse de départ est que la mutation de ces points de contrôle pourrait permettre une progression plus rapide du cycle cellulaire avec une production concomitante de lipides. D'autre part, nous voulons identifier les lincRNAs responsables du déplacement du métabolisme cellulaire vers l'accumulation de lipides, afin que ceux-ci puissent être déclenchés sans la présence d'un stress nutritif. En nous appuyant sur nos résultats précédents, nous utiliserons le raisonnement suivant : Un régulateur positif de l'accumulation des lipides serait régulé à la hausse en cas de déplétion en nutriments, puis régulé à la baisse lorsque le nutriment déplété est réapprovisionné dans le milieu et que la production de lipides s'arrête. En outre, nous pouvons également supposer qu'un régulateur négatif de la progression du cycle cellulaire entrerait également dans cette catégorie. Par ailleurs, un régulateur positif du cycle cellulaire des diatomées est susceptible d'être régulé à la baisse en cas de déplétion des nutriments et d'être régulé à la hausse lorsque le nutriment déplété est ajouté au milieu et que la division cellulaire reprend, et serait donc considéré comme un régulateur négatif de l'accumulation des lipides. L'objectif 2 est d'identifier les principaux partenaires protéiques des lincRNAs sélectionnés précédemment chez P. tricornutum. Les unes à deux meilleures souches ainsi développées seront cultivées dans des réacteurs à échelle pilote dans l'usine industrielle d'A4F, conforme aux normes sur les OGM, à Lisbonne, au Portugal. Le but principal de l'objectif 3 est de définir leur potentiel dans la production de produits de base tels que les lipides pour les biocarburants et les produits à haute valeur ajoutée pour les marchés spécialisés ainsi que la biomasse non raffinée pour les industries alimentaires et de l'alimentation animale.
Au total, 20 lincRNAs candidats qui pourraient être impliqués dans la régulation des processus moléculaires conduisant à l'accumulation de lipides et à la progression du cycle cellulaire chez P. tricornutum, seront examinés par l'équipe coordinatrice.
Afin de générer des knockouts fonctionnels complets des lincRNAs candidats, la technologie CRISPR-Cas9 est utilisée pour induire de très grandes délétions dans les loci des lincRNAs, par l'utilisation d'une stratégie de double guide ARN CRISPR-Cas9. Une fois que les plasmides hébergeant toutes les parties nécessaires pour que la machinerie CRISPR-Cas9 soit efficace chez P. tricornutum sont générés, ceux-ci seront utilisés pour transformer les diatomées (par biolistique et/ou conjugaison). Les souches mutantes de diatomées seront génotypées, par PCR et séquençage, afin de vérifier la présence de la délétion complète des loci lincRNA ciblés. Les lignées homozygotes seront ensuite sélectionnées, purifiées et cultivées en milieu liquide pour le phénotypage. Ce phénotypage consiste à évaluer différents paramètres en conditions contrôlées et appauvries en nutriments tels que la division cellulaire, la morphologie cellulaire, la production de lipides et l'expression différentielle de gènes marqueurs de stress nutritif (transporteurs de phosphate et phosphatases alcalines). Une étude transcriptomique globale par ssRNA-Seq sera entreprise dans les lignées mutantes KO les plus prometteuses (avec le phénotype le plus marqué). Ceci permettra d'identifier les voies, et les partenaires protéiques putatifs, qui sont sous la régulation des lincRNAs ciblés.
La production totale de biomasse sera mesurée pendant la période de croissance en milieu industriel complet sur les lignées mutantes de diatomées les plus prometteuses par l'équipe partenaire (A4F, Portugal). La composition de la biomasse sera analysée chimiquement afin de quantifier les principaux composants, et comparée à des cultures témoins. Les productivités globales de la biomasse totale, des protéines, des lipides (en particulier les TAG), des hydrates de carbone et de certains pigments seront calculées et comparées à celles des souches WT. Le potentiel d'industrialisation de ces souches sera évalué en fonction des résultats obtenus et par comparaison avec des normes industrielles.
La première tâche du projet consistait à générer des lignées mutantes de la diatomée P. tricornutum par le KO de lincRNAs candidats. Afin d'optimiser le taux et l'efficacité de la transformation pour la génération des lignées de diatomées mutantes, l'équipe coordinatrice a optimisé l'utilisation d'une combinaison de différentes techniques pour générer des plasmides de mutagenèse basés sur la conjugaison CRISPR-Cas9. Le protocole développé était basé sur le système uLoop dans lequel 2 plasmides correspondant, aux protéines Cas9 et aux éléments « essentiels « pour générer des gRNA CRISPR-Cas9 (Promoteur ; gRNAs; Terminateur) ont été domestiqués dans un seul plasmide avec un taux de réussite très élevé. Après avoir généré toutes les souches mutantes à l'aide du plasmide uLoop unique et conjugaison bactérienne, le criblage par PCR sur les colonies isolées a montré que des délétions très propres entre les gRNA ont été obtenues pour toutes les souches mutantes. Cependant, malgré l'utilisation de milieux de sélection successifs, nous avons constaté que la plupart de nos cultures de diatomées n'étaient pas pures à 100% (un mélange de mutants et de type sauvage et/ou de lignées hétérozygotes) puisque nous étions toujours capables de détecter l'allèle de type sauvage par amplification PCR (la contamination par le type sauvage et les souches hétérozygotes était facile à distinguer). Pour optimiser la purification des cultures, nous avons décidé d'effectuer des dilutions successives sur des plaques afin d'obtenir des colonies isolées émergeant d'une seule cellule. Nous réussissons à obtenir un protocole nous permettant de générer des lignées pures de mutants homozygotes pour nos lncRNAs candidats, dans lesquelles, en supprimant la pression de sélection, nous pourrons enlever le plasmide (épisome) contenant le système CRISPR-Cas9.
Jusqu'à présent, 15 lincRNAs candidats ayant une fonction régulatrice putative ont été ciblés par CRIPRR-Cas9 grâce au système de conjugaison. Au moins deux lignées homozygotes génétiquement indépendantes ont été obtenues pour chaque gène. La délétion des loci complets a été confirmée par un génotypage approfondi, même après la suppression de la pression de sélection (ce qui a permis la perte de l'épisome et donc de tout le matériel transgénique) pendant plusieurs générations. Ils sont actuellement en cours de phénotypage (comme décrit dans la section méthodes).
En collaboration avec M. et C. Boccara, au Museum d’Histoire Naturelle etl’Institut Langevin, l'equipe coordinatrice du projet a participé à l’étude de la dynamique cellulaire chez Phaeodactylum sous différentes contraintes expérimentales. Grâce à une méthode de microscopie non-invasive et non-destructive appelée « Dynamic Cell Imaging » (DCI), cette étude a permis notamment de suivre in vivo le dynamisme des vésicules lipidiques au cours d’une carence au phosphate. Cette collaboration a donné lieu à un papier publié dans European Journal of Phycology.
L'équipe de coordination est en train de phénotyper la banque de mutants récemment générée de lignées KO lincRNAs de Phaeodactylum tricornutum avec un rôle régulateur putatif dans les réponses au stress nutritif pour la croissance cellulaire, la production de lipides, la morphologie ainsi que l'analyse d'expression différentielle des gènes marqueurs du stress nutritif.
La prochaine étape, une fois le phénotypage terminé, est de 1) faire une étude transcriptomique des 1 à 2 lignées KO les plus prometteuses et de 2) les transférer à notre partenaire industriel, A4F, au Portugal, comme prévu. Ce deuxième volet permettra d'évaluer la production totale de biomasse dans un cadre industriel. La composition de la biomasse sera analysée chimiquement afin de quantifier les principaux composants, et comparée à des cultures témoins. Une analyse similaire de la biomasse et des composants sera effectuée après le passage à un milieu appauvri en nutriments. Les productivités globales de la biomasse totale, des protéines, des lipides (en particulier les TAG), des glucides et de certains pigments seront calculées et comparées à celles des souches WT. Le potentiel d'industrialisation de ces souches sera évalué en fonction des résultats obtenus et par comparaison avec des standards industriels.
1. Bey H, Charton F, Cruz de Carvalho H, Liu S, Dorrell RG, Bowler C, Boccara M, Boccara C (2021). Dynamic Cell Imaging: application to the diatom Phaeodactylum tricornutum under environmental stresses. European Journal of Phycology.
2. Cruz de Carvalho MH*, Bowler C (2020). Global identification of a marine diatom long noncoding natural antisense transcripts (NATs) and their response to phosphate fluctuations. Scientific Reports, 10; 14110. (*corresponding author)
Les diatomées sont des organismes très prometteurs pour la production de biocarburants puisqu'ils peuvent accumuler des quantités très élevées de lipides, en particulier lorsque les nutriments du milieu sont épuisés. Ceci, cependant, se fait au prix d'un arrêt de la croissance ce qui compromet la productivité et le rendement lipidique. Chez P. tricornutum plus de 40% des transcrits peuvent être classés en ARN(lnc) longs non codants, considérés actuellement comme des régulateurs majeurs des processus biologiques chez les eucaryotes, notamment dans la régulation du cycle cellulaire et le métabolisme lipidique. Nous émettons l'hypothèse que les ARNlnc exprimés en réponse à un stress nutritionnel sont susceptibles d'être des acteurs centraux dans des voies de régulation de la production de biomasse chez les diatomées, hypothèse corroborée par des données préliminaires. Dans ce projet, nous combinons une approche révolutionnaire en biologie des systèmes pour l'augmentation de la production de biomasse chez les diatomées par édition génique d'ARNlnc cibles, avec un partenaire industriel, dans le but de générer un portefeuille d’utilisations de la biomasse de diatomées par une approche de bioraffinerie.
Madame Helena CRUZ DE CARVALHO (Institut de biologie de l'Ecole Normale Supérieure)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
IBENS Institut de biologie de l'Ecole Normale Supérieure
A4F A4F, Algafuel, SA
Aide de l'ANR 319 781 euros
Début et durée du projet scientifique :
février 2020
- 42 Mois
