CE20 - Biologie des animaux, des organismes photosynthétiques et des microorganismes

Mécanismes moléculaires de détection de la température chez les plantes – TEMPSENS

Ce n'est qu'une phase - mécanismes moléculaires de la séparation de phase liquide-liquide de l'ELF3 et détection de la température chez Arabidopsis

La manière dont les plantes détectent la température est une question fondamentale en biologie végétale. Dans ce projet, nous étudions les déterminants au niveau moléculaire et atomique de la détection de la température médiée par la protéine EARLY FLOWERING 3 (ELF3). ELF3 subit une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) réversible en fonction de la température. Nous déterminons la base structurelle de la LLPS et introduisons des mutations ciblées pour modifier la LLPS in vitro et in vivo.

Les principaux objectifs du projet sont de déterminer comment la température affecte la LLPS de l'ELF3 et si le LLPS agit comme un mécanisme de détection directe de la température in vivo.

Les objectifs initiaux du projet étaient la production et la purification de différentes constructions d'ELF3, en particulier la région du domaine de type prion (PrD), qui est essentielle pour la séparation de phase liquide-liquide (LLPS). Les objectifs pour les 18 premiers mois du projet se concentrent sur la caractérisation in vitro de la protéine ELF3 et de la région PrD en ce qui concerne les conditions nécessaires à la LLPS. Nous avons produit avec succès de nombreuses constructions de la protéine ELF3 d'Arabidopsis thaliana et d'autres espèces (Brachypodium distachyon, Solanum tuberosum) avec et sans étiquette GFP. Ces protéines ont été caractérisées in vitro en utilisant la microscopie optique et la microscopie à fluorescence et leur dynamique a été étudiée en utilisant la récupération de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Leur comportement vis-à-vis de la concentration, de la température, du pH et de la force ionique a été déterminé et des diagrammes de phase (phases dispersée, condensée et précipitée) ont été générés en fonction de ces différentes variables. Un LLPS réversible a été démontré pour AtELF3 PrD et une série de mutants AtELF3 PrD. Les caractéristiques du LLPS en fonction de la température ont été étudiées à l'aide de tests de turbidité et d'expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). Des modèles SAXS initiaux ont été générés en utilisant les données des phases dispersées et condensées en fonction de la température. Ces études structurelles seront publiées au cours de l'année prochaine. L'optimisation des échantillons pour les études RMN à haute résolution est en cours. Des mutants ELF3 avec des LLPS altérés en fonction de la température ont été identifiés et seront testés in planta dans la deuxième partie du projet. Ces expériences permettront de corréler le LLPS in vitro avec la fonction in vivo d'ELF3 et les phénotypes sensibles à la température.

Le projet utilise différentes techniques in vitro et in vivo pour étudier les mécanismes de thermodétection au niveau moléculaire et au niveau de l'organisme dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Les principales techniques in vitro utilisées sont des techniques de biologie structurelle, à savoir la diffusion des rayons X aux petits angles et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire. Ces techniques sont réalisées en solution, ce qui permet d'étudier les propriétés dynamiques de la protéine étudiée, EARLY FLOWERING 3 (ELF3). Nous avons démontré par SAXS que ELF3 subit des changements structurels en fonction de la température pendant la formation de la phase de gouttelettes liquides. Les molécules de la protéine adoptent des conformations spécifiques dans la phase condensée. Nous préparons actuellement des échantillons pour des études détaillées de résolution atomique par RMN afin de mieux comprendre les interactions intra et intermoléculaires pendant la séparation des phases. Pour caractériser davantage la protéine in vitro, nous avons généré des constructions marquées par une protéine fluorescente de la région PrD d'ELF3. Comme dans la version non marquée, ELF3 PrD agit comme un pilote de LLPS, formant une phase condensée en fonction de différentes variables dont le pH, la concentration en protéine, la force ionique de la solution et la température. En utilisant la microscopie confocale et la récupération de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP), nous sommes en mesure d'étudier la nature dynamique de l'état de séparation de phase. Nos collaborateurs ont également montré que ce comportement est largement récapitulé in vivo, ce qui suggère que le LLPS dépendant de la température est effectivement un mécanisme de thermodétection directe chez Aranidopsis thaliana et les espèces apparentées qui possèdent une PrD dans la protéine ELF3.

Le projet TEMPSENS se concentre sur les mécanismes moléculaires de la thermosensibilité des plantes, en particulier sur le rôle de la protéine ELF3 comme thermocapteur direct. Nous avons déterminé que la PrD de la protéine ELF3 subit une séparation de phase liquide-liquide (LLPS) en fonction de différentes variables dont le pH, la concentration en protéine, la force ionique et l'augmentation des températures. La protéine en solution à basse température est monodispersée, ce que nous avons déterminé à partir des études initiales DLS et SAXS. Lorsque la température est augmentée de 4°C à 35°C, ELF3 PrD forme des gouttelettes liquides. Ces gouttelettes présentent un certain ordonnancement interne, comme l'indique l'apparition d'un pic dans la courbe de diffusion SAXS.

La dynamique de la phase des gouttelettes a été étudiée en utilisant la récupération de la fluorescence après photoblanchiment (FRAP). Les gouttelettes présentent un comportement très mobile lors de leur formation et vieillissent rapidement, avec une phase de faible mobilité qui domine après 5-10 minutes. Ce comportement est reproductible sur de nombreuses expériences et dans différentes conditions de tampon (pH, force ionique).

Afin d'examiner plus en détail les déterminants du LLPS piloté par la PrD de ELF3, nous avons commencé à faire varier systématiquement les régions polyQ présentes dans la protéine. L'allongement des polyQ et la délétion de ces acides aminés modifient le LLPS de la PrD en fonction des essais de turbidité. Nous sommes capables de modifier la température à laquelle le LLPS se produit in vitro en manipulant la longueur et la distribution des polyQ dans la PrD de la protéine.

Sur la base de ces études in vitro, nous testerons nos mutants PrD polyQ in vivo afin de corréler la fonction in vitro et in vivo. Les phénotypes des plantes -longueur de l'hypocotyle et temps de floraison à 22°C vs. 27°C des mutants et du type sauvage seront évalués.

Dans les années à venir, l'accent sera mis sur la corrélation entre nos études in vitro et la fonction in planta. Nous avons caractérisé la région PrD d'ELF3 et démontré une séparation de phase réversible et sensible à la température. Il s'agit d'un mécanisme intéressant pour la détection de la température in vivo, mais cela n'a pas été prouvé. Afin de répondre à la question de savoir si le LLPS d'ELF3 est ou non un mécanisme primaire de thermodétection chez Arabidopsis, nous nous concentrerons sur la génération de mutations hautement ciblées d'ELF3 qui présentent une formation différentielle de LLPS in vitro en fonction de la température. Ces variantes seront caractérisées dans un système hétérologue tel que la levure, puis des lignées transgéniques stables seront générées dans le fond mutant elf3 loss-of-function. Les mutants ELF3 étiquetés GFP seront examinés pour la localisation et la formation de LLPS en fonction de la température. Ceci sera corrélé avec les phénotypes des plantes observés à différentes températures de croissance. La croissance sensible à la température, y compris l'élongation de l'hypocotyle et le temps de floraison, sera déterminée pour différentes variantes d'ELF3. Cette série d'expériences permettra d'établir une corrélation solide entre le LLPS et la détection et la réponse à la température.

Nous avons deux publications majeures revues par les pairs liées à ce projet :
Silva, C. S.; Nayak, A.; Lai, X.; Hutin, S.; Hugouvieux, V.; Jung, J.-H.; López-Vidriero, I.; Franco-Zorrilla, J. M.; Panigrahi, K. C. S.; Nanao, M. H.; Wigge, P. A.; Zubieta, C. Molecular Mechanisms of Evening Complex Activity in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117 (12), 6901–6909.

Jung, J.-H.; Barbosa, A. D.; Hutin, S.; Kumita, J. R.; Gao, M.; Derwort, D.; Silva, C. S.; Lai, X.; Pierre, E.; Geng, F.; Kim, S.-B.; Baek, S.; Zubieta, C.; Jaeger, K. E.; Wigge, P. A. A Prion-like Domain in ELF3 Functions as a Thermosensor in Arabidopsis. Nature 2020, 585 (7824), 256–260.

Outre les publications dans des revues à comité de lecture, nous avons mené diverses activités de vulgarisation pour diffuser nos résultats au CEA, à Grenoble (CEA «fait marquant«) et auprès du grand public, notamment des contributions sur ce sujet dans «The Conversation«, des interviews pour «Silence, ça pousse« et des bulletins d'information locaux.

La durée du jour et la température sont les principaux facteurs environnementaux qui influent sur la croissance, le développement et la reproduction des plantes. En raison du réchauffement climatique, les espèces végétales doivent adapter leur cycle de vie à la hausse des températures. Les effets du changement climatique ont déjà eu un impact profond sur la phénologie des espèces de plantes sauvages et cultivées. Par conséquent, comprendre comment les plantes perçoivent et réagissent à la température est un défi fondamental. Différents mécanismes, notamment des modifications de la structure de certaines protéines, leur permettent d’agir en tant que thermosenseurs directs. Des analyses chez Arabidopsis ont permis d'identifier quelques thermocapteurs protéiques présumés, notamment EARLY FLOWERING (ELF3), une protéine qui interagit avec de nombreux partenaires différents, notamment le phytochrome B, PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR4, LUX ARRYTHMO et EARLY FLOWERING 4. Toutes ces protéines sont impliquées dans la thermomorphogenèse qui se traduit par un ensemble de modifications adaptatives incluant un allongement de l'hypocotyle et une transition précoce vers la floraison. ELF3 jouerait le rôle de thermocapteur direct et de coordinateur de la croissance en réponse aux variations de températures. Comment ELF3 perçoit et transmet les signaux de température n'est pas connu. Le projet portera directement sur les mécanismes moléculaires de la fonction d’ELF3 et de son activité thermosensorielle chez Arabidopsis.

ELF3 est une protéine intrinsèquement désordonnée avec un domaine prion (PrLD). Les protéines intrinsèquement désordonnées et les domaines PrLD peuvent subir des transitions de phase et former des gouttelettes liquides très denses. In vivo, les gouttelettes liquides agissent comme des organites sans membrane et sont capables de concentrer des molécules partenaires et de modifier leur activité, permettant ainsi de compartimenter les processus biologiques. Les gouttelettes liquides ont été impliquées dans divers processus, notamment la transcription, le métabolisme des ARNs, la réponse au stress et la formation de sites de stockage inactifs pour les protéines et l'ARN. Nos résultats préliminaires démontrent que le domaine PrLD d’ELF3 est suffisant pour former des gouttelettes liquides et que leur formation est sensible à la température. Nous suggérons que le domaine PrLD d’ELF3 est requis pour l'activité thermosensorielle de la protéine chez Arabidopsis et que cette thermosensibilité nécessite la formation de gouttelettes. Le projet abordera les mécanismes moléculaires de la formation de gouttelettes liquides chez ELF3 in vitro, déterminera son incidence sur l'activité de la protéine, y compris les interactions avec différents partenaires protéiques, et examinera les protéines ELF3 d’autres espèces présentant des réponses à la température altérées. Le projet s'appuie sur une approche intégrée pour répondre à la question fondamentale du rôle biologique de la formation de gouttelettes liquides. In vitro, la microscopie de fluorescence et les analyses structurales en solution fourniront la base moléculaire pour la formation des gouttelettes, l’interaction avec les protéines partenaires et détermineront les effets de la température sur la stabilité et la dynamique des gouttelettes. Les expériences in vivo chez Arabidopsis, sur protoplastes et plantes entières, permettront d'établir une corrélation entre le comportement des gouttelettes in vitro et leur fonction au niveau cellulaire et de l'organisme. Le projet proposé fournira une compréhension fondamentale de la formation de gouttelettes liquides de la protéine ELF3, leur dynamique et déterminera le rôle des gouttelettes liquides dans la thermosensibilité chez Arabidopsis. Ces études auront de nombreuses applications sur d'autres espèces en raison de la nature ubiquitaire des gouttelettes liquides et de leur rôle potentiel en tant que capteurs des changements environnementaux.

Coordinateur du projet

Madame Chloe Zubieta (CEA)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

LPCV CEA
IBS INSTITUT DE BIOLOGIE STRUCTURALE

Aide de l'ANR 456 840 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2019 - 48 Mois

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