Impact du métabolisme de la glutamine dans les complications cardio-vasculaires dans le diabète – GlutaDiab

GLUTADIAB aborde l'hypothèse selon laquelle la diminution de la concentration sanguine de glutamine dans le diabète reflète une augmentation de la glutaminolyse dans les monocytes sanguins et les macrophages tissulaires, favorisant ainsi un changement de polarisation des monocytes/macrophages par le biais de modifications d'expression génique. La réponse immuno-inflammatoire est exacerbée, augmentant ainsi le risque de développer des complications cardiovasculaires.

Pour répondre à cette hypothèse, le projet est construit autour de trois principaux work packages.

WP1 : Évaluer l'association causale de la glutamine avec le risque d'événements cardiovasculaires au cours du diabète.
1.1- Valider et identifier de nouveaux loci génétiques associés à la concentration plasmatique de glutamine chez 39 563 participants de trois cohortes indépendantes -> analyses GWAS
1.2- Associer les scores génétiques de la glutamine aux événements cardiovasculaires dans le diabète -> Randomisation mendélienne

WP2 : Quantification du métabolisme de la glutamine dans le sérum et les monocytes de patients DT1 et DT2 à risque faible vs élevé d'événements cardiovasculaires en relation avec leur reprogrammation métabolique - étude clinique
2.1- Recruter des patients en quatre groupes selon leur statuts cardiovasculaire et diabétique : DT1 / DT2 / non diabétique + risque élevé ou faible de complications / pas de complications / antécédent de maladie cardiovasculaire
2.2- Identifier les métabolites de la glutamine dans les monocytes sanguins des patients et associer les métabolites de la glutamine au statut d'activation des monocytes et au profil transcriptomique.
2.3- Caractériser le programme transcriptomique à travers une modification de l'expression des gènes et les changements épigénétiques liés à l'activité KDM6B et TET2 dans les monocytes sanguins de la population étudiée.

WP3 : Élucider les déterminants moléculaires impliqués dans la voie de la glutamine et qui orchestrent la reprogrammation de la polarisation monocytes/macrophages
3.1- Démontrer qu'une déficience spécifique en GLS1, TET2 et KDM6B dans les cellules myéloïdes interfère avec le développement de l'athérosclérose chez les souris diabétiques (modèles de DT1 et DT2).

1-L'accord de consortium (entre l'APHP et l'Inserm) encadrant GLUTADIAB a été signé le 5 février 2021.

2- Concernant l'étude clinique: nous avons obtenu l'avis du comité d'éthique le 9 juillet 2020 (CPP : 54/20_3, N° dossier SI : 20.06.08.73925). GLUTADIAB dispose désormais d'un identifiant ClinicalTrials.gov : NCT04353869. L'eCRF a été mis en place par l'URC de l'hôpital Bichat et est actuellement utilisé dans les centres de recrutement. Le recrutement pour l'étude a été impacté par la crise du COVID19 mais a repris depuis la fin du confinement. A l'hôpital Bichat, le recrutement a débuté le 16/11/2020, avec 108 patients DT2 et 4 DT1 à ce jour. Les inclusions ont débuté à l'hôpital Lariboisière le 2/02/2021. A ce jour, il y a 89 patients DT2 et 11 DT1 inclus (WP2.1). Des analyses sont en cours depuis, pour identifier les métabolites de la glutamine dans les monocytes sanguins des patients (WP2.2).

3- Des expériences in vivo ont été réalisées sur des modèles murins de diabète et d'athérosclérose. KDM6B dans les macrophages semble jouer une fonction clé dans la polarisation des macrophages périvasculaires. La perte de KDM6B dans les macrophages peut favoriser la formation de plaques d'athérosclérose et une expansion inadéquate du tissu adipeux en cas d'obésité et de diabète induits par l'alimentation. Les travaux sur les mécanismes moléculaires impliqués sont en cours. Par ailleurs, nous avons observé que le déficit en Gls1 des macrophages peut être compensé par une modification du flux de glutamine médiée par la glutamine synthase (GS). Nous avons effectué un séquençage d'ARN dans des macrophages déficients en Gls1 en présence ou en l'absence d'un inhibiteur de la GS nommé méthionine sulfoximine (MSO). La déficience en Gls1 et l'inhibition de la GS limitent la signature du gène de phosphorylation oxydative mitochondriale et que ces effets ne sont pas additifs. Des analyses de flux extracellulaires « Seahorse » ont confirmé ces résultats. Cependant, nous avons constaté que la déficience en Gls1 réduisait la polarisation et l'efferocytose des macrophages mais pas l'inhibition de la GS. L'inhibition de la GS modifie plutôt l'organisation membranaire et le processus de survie. Ce dernier mécanisme semble être en corrélation avec une activité Tet2 réduite. Nous étudions actuellement comment la modulation du flux de glutamine dans les macrophages affecte différemment leurs fonctions. Pour répondre à la pertinence in vivo de ces observations, des souris diabétiques témoins ou déficientes en Gls1 dans les macrophages ont été traitées pendant 3 semaines avec ou sans MSO. Le déficit en Gls1 dans les macrophages et l'inhibition de la GS ont accéléré l'inflammation pancréatique, un effet d’autant plus important avec une activité réduite des deux enzymes. Nos résultats suggèrent une modulation fine du flux de glutamine par Gls1 et GS qui ont des rôles complémentaires dans la prévention de l'inflammation des macrophages pancréatiques induite par le diabète.

- Identification d'une fonction inattendue de KDM6B dans le contrôle de la fonction et de l'activation des macrophages périvasculaires.
- Identification d'un rôle crucial de Gls1 et GS dans la modulation du flux de glutamine dans les macrophages avec un rôle différent mais complémentaire dans l'inflammation des macrophages pancréatiques induite par le diabète.

Malgré la pandémie de COVID-19, nous avons réussi à inclure plus de 200 patients diabétiques et réalisé des expériences in vivo clés dans nos différents modèles de souris. De nouveaux concepts semblent émerger de nos résultats préliminaires qui doivent être confirmés dans la deuxième partie du projet.

Les publications cliniques et fondamentales sont attendues en 2022.

Un pourcentage élevé de patients diabétiques développe des maladies macro-vasculaires telles que l'athérosclérose. Cette complication est associée à une inflammation exacerbée, caractérisée par l'activation des monocytes sanguins et des macrophages tissulaires dans un état pro-inflammatoire. De plus en plus de preuves suggèrent que les modifications des voies métaboliques intracellulaires dans les monocytes et les macrophages influencent leur devenir et leur fonctionnalité. Parmi les voies métaboliques, le cycle du TCA (ou cycle de Krebs) est un point de contrôle crucial qui contribue à l'activation des cellules immunitaires. Le glutamate dérivé de la glutamine (appelé glutaminolyse) est un carburant essentiel pour le cycle du TCA afin de générer des intermédiaires de TCA qui orientent le statut d'activation des monocytes. Dans notre projet, nous émettons l'hypothèse que la diminution documentée de la concentration sanguine de glutamine dans le diabète (résultats préliminaires) reflète une glutaminolyse accrue des monocytes sanguins et des macrophages tissulaires, ce qui favorise l’activation des monocytes / macrophages par modification du programme d'expression génique. En conséquence de ce changement métabolique, la réponse immunitaire / inflammatoire est exacerbée, ce qui augmente le risque de développer des complications cardiovasculaires chez les sujets diabétiques. La modification des voies dépendantes de la glutamine dans les monocytes / macrophages pourrait ainsi limiter le phénotype inflammatoire et les événements CV dans le diabète. Nous proposons ici de tester cette hypothèse en combinant des études humaines des analyses moléculaires et épigénomiques et l’utilisation de modèles murins uniques pour disséquer le métabolisme de la glutamine dans les monocytes et les macrophages, dans le but de démontrer que cette voie est impliquée dans le développement de complications cardiovasculaires dans le diabète. Nos 3 objectifs principaux sont:

1 / Évaluer le lien de causalité entre la glutamine et le risque d'événements cardiovasculaires chez les diabètes de type 1 et 2: Nous effectuerons une méta-analyse d'études d'association pangénomique (approche type Randomisation Mendélienne) sur la glutamine plasmatique chez 39 563 participants et étudierons le lien de causalité entre la glutamine et les événements cardiovasculaires dans les cohortes de diabètes de 9 130 participants (Parmi les 9 130 participants, 2 162 ont développés un évènement).

2 / Quantifier le métabolisme de la glutamine dans le sérum et les monocytes de patients diabétiques de types 1 et 2 présentant un risque faible ou élevé de développer un événement cardiovasculaire: L’objectif principal de cette tâche sera de corréler les taux plasmatiques de glutamine avec les métabolites de la glutamine dans les monocytes sanguins (cellules CD14 +: population monocyte principale) des sujets diabétiques avec un risque supplémentaire de complications cardiovasculaires (faible ou élevé). De plus, nous mesurerons le programme transcriptomique en mesurant l'expression des gènes et les changements épigénétiques des monocytes sanguin provenant de populations diabétiques.

3 / Élucider les déterminants moléculaires impliqués dans la détection des voies de la glutamine qui orchestrent la reprogrammation de la polarisation des monocytes / macrophages. La caractérisation fonctionnelle de GLS1, TET2 et KDM6B (connue pour être sensible aux intermédiaires de la glutamine) dans la polarisation des macrophages dans le contexte du diabète n'est pas très bien définie. En utilisant des modèles de souris uniques développés par le consortium, nous visons à démontrer que l’invalidation spécifique en GLS1, TET2 et KDM6B dans les cellules myéloïdes interfère avec le développement de l’athérosclérose chez la souris diabétique.