Exploration physiopathologique de la myopathie de Bethlem à l’aide d’un modèle de poisson zèbre – FishandCol6

- La technique de silicone clamp et de patch clamp en canal isolé sera utilisée pour mesurer les mouvements de charges intramembranaires, les potentiels d’action et les propriétés biophysiques des canaux ioniques voltage-dépendants, activés par l’étirement membranaire, actifs au repos sur la fibre musculaire squelettique isolée de troncs de poissons zèbres au stade larvaire et âgés d’un an.
- Les concentrations de calcium de repos sous contrôle de potentiel et les variations de calcium intracellulaire induites par la dépolarisation seront mesurées sur des fibres dont le potentiel interne est contrôlé en utilisant un indicateur calcique dialysé dans la cellule à travers la pipette de patch afin d’étudier la libération de calcium par le réticulum sarcoplasmique (RS) et les capacités de recapture du calcium par le RS.
- L’influx de Ca2+ d’origine extracellulaire sera mesuré à l’aide de la technique à haute résolution d’extinction de fluorescence par le Mn2+ au potentiel de repos et en réponse à des impulsions dépolarisantes induisant des déplétions calciques du RS.
- Les performances de nage et la consommation d’O2 des poissons seront évaluées en conditions naturelles en plaçant les animaux dans un tunnel de nage imposant des vitesses de flux croissantes jusqu’à épuisement. La force musculaire spécifique en secousse et en condition tétanique développée par des troncs musculaires stimulés électriquement sera mesurée sur des larves et des poissons adultes à l’aide d’un transducteur de force isométrique conçu au laboratoire.
- La localisation par immunohistochimie de canaux ioniques et de protéines impliquées dans la régulation du Ca2+ sera analysée en microscopie confocale à fluorescence.
- Les patrons d’expression spatio-temporelle de ColVI et de ses partenaires matriciels dans la myomatrice seront étudiés par immunohistochimie et biochimiquement et en créant une lignée transgénique de gène rapporteur exprimant une protéine fluorescente sous le contrôle du promoteur de col6a1.
- L’assemblage supramoléculaire de la protéine trimérique contenant la chaîne a1 tronquée à différents stades de développement du poisson sera caractérisé à l’aide de gels composites agarose-acrylamide conçus pour des protéines à haut poids moléculaire.
- Une analyse transcriptomique par RNAseq sera utilisée pour identifier les gènes dérégulés chez les larves et les poissons adultes col6a1?ex14-/-, spécifiquement les gènes codant les protéines du matrisome et les protéines impliquées dans la signalisation calcique. Une sélection des gènes dérégulés sera validée au niveau protéique.

A l’aide de techniques de potentiel- et de courant-imposé combinées à la mesure de Ca2+ intracellulaire, sur des fibres isolées de poissons âgés d’un an qui s’avèrent plus sévèrement affectés que les poissons jeunes, nous avons montré que (i) les potentiels d’action sont inchangés chez les poissons mutants, (ii) la voltage-dépendance des mouvements de charge générés par l’activation des récepteurs aux dihydropyridines (DHPR) qui contrôlent la libération de Ca2+ par le RS est glissée vers les potentiels négatifs chez le poisson mutant, (iii) la voltage-dépendance des transitoires Ca2+ induits par la dépolarisation est glissée vers les potentiels négatifs chez le poisson mutant sur toute la gamme de potentiels, potentialisant ainsi une fuite de Ca2+ du RS aux potentiels de repos pouvant possiblement expliquer la perte musculaire observée dans la BM. Ces données valident ainsi notre hypothèse initiale quant aux mécanismes pathogéniques impliqués dans la BM. En parallèle, nous avons réalisé une caractérisation détaillée des étapes du couplage excitation-contraction chez les poissons sauvages, qui a révélé de manière inattendue des cinétiques ultrarapides d’activation. Nous avons aussi identifié et cloné un canal K+ à 2 domaines pores dans le muscle adulte de poisson jamais décrit dans un muscle squelettique de vertébré qui confère à l’excitation de la cellule musculaire de poisson une sensibilité à l’étirement et à la chaleur. Le génome de poisson zèbre contient deux paralogues du gène humain, kcnk4a et kcnk4b. Nous avons montré par q-PCR et patch-clamp que le kcnk4b commence à s’exprimer et devient fonctionnel après la métamorphose des larves.
Grace aux anticorps générés contre la protéine ColVIa1 de poisson, nous avons montré que, contrairement au poisson sauvage, l’immunoréactivité de ColVI est anormalement présente sous la forme de petits amas irréguliers dans le muscle de larves chez le mutant puis disparaît quasiment complètement à l’âge adulte. Ceci pourrait expliquer l’aggravation du phénotype avec l’âge des poissons. Aucune immunoréactivité n’a été décelée dans les muscles du tronc de larves ou adultes de poissons invalidés pour col6a1 (lignée fournie par P. Bonaldo, Italie). Entre temps, nous avons généré des anticorps dirigés contre la chaîne ColVIa1 de poisson chez le cobaye et confirmé ces observations. Ces nouveaux anticorps permettent de réaliser des doubles marquages avec des marqueurs du muscle et de la myomatrice et d’explorer ainsi avec plus de détails le phénotype mutant. Ils sont utilisables en Western blot et nous ont permis de confirmer biochimiquement les données d’immunomarquage. Enfin, une 1ière série de mesure de performance de nage a été réalisée sur les poissons hétérozygotes col6a1?ex14/+ et a montré que la vitesse de nage critique (Ucrit exprimée en longueur de poisson/s) est plus faible chez les poissons mutants comparée aux contrôles. Une série d’expériences sur les poissons col6a1?ex14-/- est en cours.

A ce stade, les résultats marquants suivants ont été obtenus : (i) démonstration de propriétés ultra-rapides du couplage excitation-contraction de la fibre musculaire squelettique de poisson zèbre adulte, (ii) identification et caractérisation fonctionnelle d’un canal K+ mécano-sensible dans la fibre musculaire squelettique de poisson zèbre adulte, (iii) altération du contrôle de l’efflux de Ca2+ du réticulum sarcoplasmique dans la fibre musculaire squelettique de poisson zèbre modèle de la BM, (iv) la protéine ColVI tronquée est dans un premier temps sécrétée mais ne s’assemble pas correctement dans la myomatrice puis disparaît à l’âge adulte, (v) les poissons hétérozygotes pour la mutation présentent une performance musculaire réduite par rapport aux poissons sauvages.
La prochaine étape sera d’analyser la force musculaire en réponse à des stimulation électriques. Ces mesures devraient corréler avec les mesures de performance de nage. De plus, des analyses par RNAseq sur muscles isolés seront réalisées afin de déterminer comment l’altération d’une protéine de la matrice extracellulaire peut perturber la fonction musculaire, comme il l’a été envisagé dans notre projet initial, si ce n’est que du scRNAseq sera préféré à du « bulk RNAseq ».
Les prochains mois seront aussi dédiés à l’étude de l’influx calcique trans-sarcolemmal et de la « store-operated Ca2+ entry » (SOCE) dans les fibres mutantes. La mise en évidence d’une fuite de Ca2+ du RS exacerbée au potentiel de repos chez les poissons mutants pourrait en effet impliquer qu’une déplétion calcique chronique du RS suractive SOCE comme il est observé dans les conditions dystrophiques. D’autre part, nous envisageons de déterminer si une interaction directe ou indirecte existe entre ColVI et la sous-unité principale du DHPR en utilisant des approches d’histochimie, de Proximity Ligation Assays (PLA) et de co-immunoprécipitation à l’aide des anticorps anti-ColVIa1 nouvellement générés.

- Liste des publications multipartenaires (résultant d’un travail mené en commun)
Revues à comité de lecture :
Idoux R, Bretaud S, Berthier C, Jacquemond V, Ruggiero F, Allard B. Étude physiopathologique de la myopathie de Bethlem à l’aide d’un modèle de poisson zèbre – 16èmes Journées de la Société Française de Myologie (JSFM) - Prix Master 2018 R. Idoux. Med. Sci. (Paris) 35 Hors-série n° 2:39-42 (2019).

Communications (conférence) :
1. Idoux R, Bretaud S, Berthier C, Jacquemond V, Ruggiero F, Allard B. Investigation of excitability and Ca2+ handling defects in skeletal muscle fibers from a zebrafish model of Bethlem myopathy. Communication orale 17èmes JSFM - Brest (Nov 2020).
2. Idoux R, Bretaud S, Berthier C, Jacquemond V, Ruggiero F, Allard B. Investigation of excitability and Ca2+ handling defects in skeletal muscle fibers from a zebrafish model of Bethlem myopathy. Oral presentation (visio-conference) Muscle Science Talks (Janv 2021).

Conférences de vulgarisation :
Idoux R, Bretaud S, Berthier C, Jacquemond V, Ruggiero F, Allard B. Présentation vulgarisée du projet FishandCol6 dans le cadre de l’opération « 1000 chercheurs dans les écoles » Saint- Etienne (Nov 2020).

- Liste des publications monopartenaires (impliquant un seul partenaire)
Communications (conférences)
Idoux R, Berthier C, Jacquemond V, Allard B. Recordings of action potentials, charge movements, and sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in isolated adult zebrafish fast skeletal muscle fibers reveals very fast kinetics of excitation–contraction coupling: Calcium Signaling and Excitation–Contraction in Cardiac, Skeletal and Smooth Muscle. Oral communication (visio-conference) - EC coupling meeting 2021. J Gen Physiol 154:e2021ecc14 (2022).
Idoux R, Berthier C, Jacquemond V, Allard B. Comprehensive characterization of excitation-contraction coupling in isolated adult zebrafish fast skeletal muscle fibers reveals superfast excitation-contraction coupling properties. Poster 18èmes JSFM Saint-Etienne (Nov 2021).

La myopathie de Bethlem (BM) est une maladie caractérisée par des contractures et une faiblesse musculaire. La BM résulte de mutations dans un des gènes codant pour les 3 principales chaînes a du collagène VI (ColVI), un composant de la myomatrice. Dans le muscle squelettique, ColVI est produit par les fibroblastes et une question non résolue est de comprendre comment l’altération de ColVI induit des modifications fonctionnelles dans les fibres musculaires. Pour tenter de répondre à cette question, une souris invalidée pour le gène codant la chaîne a1 de ColVI a été créée. Ce modèle a révélé une force musculaire réduite, des modifications ultrastructurales du réticulum sarcoplasmique (RS) et des altérations mitochondriales. L’inhibition de l’expression de différentes chaînes a de ColVI par injection de morpholinos chez le poisson zèbre a aussi montré conduire à des anomalies analogues dans le muscle. Bien que ces modèles aient contribué à une meilleure compréhension des maladies liées à ColVI, aucun de ces modèles ne reproduit fidèlement les mutations portées par les patients BM. Afin de mieux reproduire la pathologie, le partenaire 2 a généré une lignée de poisson zèbre portant la mutation la plus fréquemment retrouvée chez les patients BM, consistant au saut d'exon 14 dans l'ARNm de col6a1 (col6a1?ex14). Dans ce modèle, une analyse ultrastructurale a révélé des anomalies des fibres musculaires, un RS dilaté, des mitochondries altérées et des sarcomères mal alignés, qui tous constituent des marques distinctives de la maladie. L'objectif général du présent projet est d'utiliser ce modèle animal pour identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la BM. Outre le caractère unique de ce modèle pour la BM, le poisson zèbre est aujourd’hui reconnu comme modèle de premier choix pour élucider les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les maladies humaines et mener des études génétiques et développementales. Notre hypothèse de travail est que le ColVI muté perturbe l'excitabilité et/ou l’homéostasie Ca2+ musculaire. Cette hypothèse est basée sur le fait que (i) dans les différents modèles animaux déficients en ColVI utilisés jusqu'à présent, la structure du RS, qui joue un rôle central dans l'homéostasie Ca2+, est altérée, (ii) les composants de la matrice ont été montrés réguler les canaux ioniques, (iii) l’homéostasie Ca2+ est sous le contrôle étroit des canaux ioniques et joue un rôle crucial dans la fonction et les pathologies musculaires, (iv) des résultats préliminaires obtenus par les 2 partenaires montrent dans les poissons col6a1?ex14 une réduction de l’immunomarquage du canal Ca2+ du RS et de la densité des mouvements de charge reflétant l’activité du complexe protéique contrôlant la libération de Ca2+.
Ce projet est mené par 2 équipes expertes en électrophysiologie musculaire et mesure du Ca2+ intracellulaire (Partenaire 1), et en biologie et pathologie du collagène et l’utilisation du modèle poisson zèbre (Partenaire 2). Le projet consiste en 5 tâches qui, en comparant du stade larvaire à adulte des poissons sauvages et col6a1?ex14, visent à (i) réaliser une analyse phénotypique musculaire, allant du profil transcriptomique, la biosynthèse de ColVI, à l’ultrastructure du muscle, (ii) analyser l’excitabilité musculaire, les propriétés des canaux ioniques et l’effet de l’étirement membranaire sur les conductances ioniques, (iii) mesurer le Ca2+ intracellulaire de repos et analyser les propriétés du couplage excitation-contraction, (iv) mesurer l'influx Ca2+ de repos et l'entrée de Ca2+ activée par la vidange Ca2+ du RS, (v) évaluer la performance de nage et la force des muscles du tronc.
Au niveau fondamental, ce projet devrait contribuer à mieux comprendre comment la myomatrice influe sur la fonction musculaire. En déterminant quelles fonctions musculaires sont altérées dans la BM, il devrait aussi conduire à identifier des cibles thérapeutiques pour traiter cette pathologie actuellement incurable.