CE12 - Génétique, génomique et ARN

Réparation des dommages ou mort cellulaire chez les bactéries exposées aux stress – NOVOREP

Vivre ou Mourir, telle est la Réponse

Le projet a pour ambition de caractériser entièrement, du signal aux réponses cellulaires, un nouveau mécanisme bactérien de réponse au stress dans lequel deux protéines, une métalloprotéase et un régulateur transcriptionnel, contrôlent l'expression de gènes connus et certains encore inconnus, conduisant à la survie cellulaire ou à une mort de type apoptotique.

Re´paration des dommages ou mort cellulaire chez les bacte´ries expose´es aux stress

Les bactéries sont fréquemment exposées à diverses conditions de stress dans la nature, lors de procédés industriels, ou quand elles sont confrontées au système immunitaire humain ou aux antibiotiques. Les bactéries ont développé de nombreux mécanismes de défense, de réponse au stress et de réparation, qui sont cruciaux pour leur survie, mais qui génèrent des problèmes de santé publique en cas de survie de pathogènes. Élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les diverses stratégies mises en place par les bactéries est essentiel pour pouvoir développer de nouvelles applications thérapeutiques et industrielles. Nous avons mis en évidence chez les Déinocoques, bactéries qui sont très résistantes aux radiations et au stress oxydant, un nouveau mécanisme de réponse aux radiations, qui permet leur survie. Ce mécanisme, partiellement élucidé, implique deux protéines clés : une métallopeptidase qui, après stress, clive et inactive le répresseur de la réponse aux radiations. Ce répresseur est essentiel à la viabilité des cellules et sa déplétion prolongée induit une mort cellulaire programmée, de type apoptose, phénomène peu étudié chez les bactéries. Des protéines, non caractérisées, similaires à ce couple protéase/répresseur sont présentes dans de très nombreuses bactéries, y compris chez des pathogènes humains, dans lesquels elles pourraient réguler diverses réponses au stress. Combinant diverses approches, notre projet vise à (1) identifier le signal moléculaire induit après stress qui déclenche le clivage du répresseur, (2) déterminer comment le répresseur interagit avec la protéase et son ADN cible, (3) identifier et caractériser les gènes impliqués dans la mort par apoptose, et (4) caractériser des couples protéase/répresseur similaires issus d’autres bactéries, notamment de pathogènes. Ce projet de recherche, à fort potentiel innovant, permettra d’ouvrir la voie à des applications dans les domaines de la biotechnologie et la conception de médicaments.

Diverses méthodes seront utilisées pour caractériser la réponse appelée « radiation/dessiccation response » (RDR) contrôlée par la métallopeptidase IrrE et le répresseur transcriptionnel DdrO chez Deinococcus. De plus, plusieurs paires de protéines similaires à IrrE et DdrO provenant d'autres bactéries seront caractérisées. Les approches utilisées comprennent la génétique (construction de mutants de délétion de gènes et de gènes codant pour des protéines avec des domaines supprimés ou avec des substitutions d'acides aminés), la microbiologie et la microscopie (caractérisation de souches sauvages et mutantes après exposition à plusieurs conditions de stress et/ou à divers agents), la biochimie (pour caractériser les interactions et l'activité des protéines purifiées), la biologie structurale (y compris la cristallographie aux rayons X ; des protéines et des complexes de macromolécules), des approches « omics » comme le RNA-Seq (pour identifier les gènes régulés directement ou indirectement par DdrO à différents moments après induction de la réponse), et le ChIP-Seq (pour identifier les sites cibles de DdrO dans les cellules).

(Juin 2021)
Nous avons montré que la métallopeptidase IrrE est activée chez Deinococcus par une disponibilité accrue d'ions zinc après stress. Les radiations et le stress oxydant induisent des changements de l'homéostasie redox, et nous proposons qu'une partie du pool de zinc coordonné par les résidus cystéine dans les protéines est libérée suite à l’oxydation des cystéines, devenant ainsi disponible pour activer la fonction peptidase de IrrE (Magerand et al, 2021).
Le répresseur DdrO a également été caractérisé par différentes méthodes, dont la cristallographie aux rayons X. Nous avons montré que DdrO est composé d'un domaine de liaison à l'ADN et d'un domaine de dimérisation original. Ce dernier est nécessaire pour la liaison à l'ADN de DdrO et son clivage par IrrE à un endroit spécifique abolit la dimérisation du répresseur et de fait sa liaison à l'ADN. Les données montrent également que IrrE clive DdrO quand le dernier est sous forme monomérique. Le rôle clé de plusieurs résidus de DdrO a été confirmé in vitro et également in vivo au sein des cellules. L’ensemble de ces données nous a permis de proposer le mécanisme de levée de répression à un niveau moléculaire (de Groot et al, 2019).

(Juin 2021)
Des expériences sont en cours pour caractériser d'autres aspects du mécanisme de réponse et de ses résultats.

Magerand R, Rey P, Blanchard L, de Groot A. 2021. Redox signaling through zinc activates the radiation response in Deinococcus bacteria. Sci Rep. 11(1):4528. doi: 10.1038/s41598-021-84026-x.

de Groot A, Siponen MI, Magerand R, Eugénie N, Martin-Arevalillo R, Doloy J, Lemaire D, Brandelet G, Parcy F, Dumas R, Roche P, Servant P, Confalonieri F, Arnoux P, Pignol D, Blanchard L. 2019. Crystal structure of the transcriptional repressor DdrO: insight into the metalloprotease/repressor-controlled radiation response in Deinococcus. Nucleic Acids Res. 47(21):11403-11417. doi: 10.1093/nar/gkz883.

Blanchard L, de Groot A. 2021. Coexistence of SOS-Dependent and SOS-Independent Regulation of DNA Repair Genes in Radiation-Resistant Deinococcus Bacteria. Cells 10(4):924. doi: 10.3390/cells10040924.

Notre projet s'inscrit dans le contexte des mécanismes de défense et de réponses aux stress bactériens, dont les découvertes sont en pleine expansion. Les bactéries sont fréquemment exposées à des conditions toxiques ou défavorables dans la nature, lors de procédés industriels, ou quand elles sont confrontées au système immunitaire humain ou à des traitements antibiotiques. Les bactéries ont développé de très nombreux mécanismes de défense, de réponse au stress et de réparation, qui sont cruciaux pour leur survie, mais qui génèrent des problèmes de santé publique en cas de survie de pathogènes. Elucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les diverses stratégies mises en place par les bactéries est essentiel pour pouvoir développer de nouvelles applications thérapeutiques et industrielles. Nous avons mis en évidence chez les déinocoques, bactéries extrêmement résistantes aux radiations et au stress oxydant, un nouveau mécanisme de réponse aux radiations, qui permet leur survie. Ce mécanisme, partiellement élucidé, implique deux protéines clés : une métallopeptidase qui, après stress, clive et inactive spécifiquement le répresseur de la réponse aux radiations. Ce répresseur est essentiel à la viabilité de la cellule et sa déplétion prolongée induit une mort cellulaire programmée, de type apoptose, phénomène peu étudié chez les bactéries. Des protéines, non caractérisées, semblables à ce couple protéase/répresseur sont présentes dans de très nombreuses bactéries, y compris chez les pathogènes humains, dans lesquels elles pourraient réguler diverses réponses au stress. Combinant génétique, génomique fonctionnelle, biologie moléculaire, biochimie, microscopie et biologie structurale, notre projet vise à (1) identifier le signal moléculaire induit après stress qui déclenche le clivage du répresseur, (2) déterminer comment le répresseur interagit avec la protéase et son ADN cible, (3) identifier et caractériser les gènes impliqués dans la mort par apoptose, et (4) caractériser des couples protéase/répresseur similaires d’autres bactéries, notamment issues de pathogènes. Ce projet de recherche, à fort potentiel innovant, permettra d’ouvrir la voie à des applications dans les domaines de la biotechnologie et de la conception de médicaments.

Coordination du projet

Arjan DE GROOT (Institut de biosciences et biotechnologies d'Aix-Marseille)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

BIAM Institut de biosciences et biotechnologies d'Aix-Marseille
I2BC Institut de Biologie Intégrative de la Cellule

Aide de l'ANR 382 192 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2019 - 48 Mois

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