Contrôle de la Réplication chez les Bactéries à Multiple Chromosomes – RepliChroms

Nous utiliserons une combinaison d'études de pointe sur l'ensemble du génome (c'est-à-dire la capture de la conformation des chromosomes «3C«, l'analyse de la fréquence des marqueurs «MFA« et le séquençage par immunoprécipitation de la chromatine «ChIP-Seq«). L'avantage de ces techniques est qu'elles peuvent être appliquées universellement à tout organisme cultivable avec un minimum de perturbations de la condition physique.
Afin d'améliorer la résolution de notre analyse, nous confronterons nos résultats obtenus à partir d'analyses de génome entier et de population à des études sur une seule cellule. Nous utiliserons la microscopie à fluorescence à cellules vivantes et la PCR numérique. Cela devrait permettre d'obtenir des résultats complémentaires tels que les fluctuations entre cellules ou la chorégraphie spatiale et temporelle des facteurs de réplication. Au-delà de ce qui a déjà été développé dans notre laboratoire, nous allons (1) améliorer la microscopie à fluorescence à cellules vivantes chez Vibrio pour suivre simultanément trois loci et (2) mettre en œuvre l'analyse PCR numérique à cellule unique pour démasquer les phénotypes hétérogènes dans les cellules individuelles. L'ensemble des résultats combinés nous aidera à dresser une image plus complète des mécanismes cellulaires qui coordonnent la réplication de réplicons multiples.

- crtS agit comme un site anti-inhibiteur en empêchant les sites inhibiteurs dans ori2 de réprimer l'initiation de Chr2.
- La réplication coordonnée des deux chromosomes de Vibrio cholerae a nécessité l'acquisition par l'initiateur RctB d'un domaine unique.
- La queue extrême C-terminale de RctB est cruciale pour le contrôle exercé par crtS.

RepliChroms vise à fournir un modèle précis de l'adaptation des plasmides et de leur domestication en tant que chromosomes secondaires chez des hôtes ayant une importance pathogène et environnementale. Ce projet fournira une description détaillée de la coordination de la réplication au cycle cellulaire, qui est une étape transitoire importante dans la domestication des plasmides en chromosomes. Notre recherche décrira le mécanisme moléculaire d'un nouveau point de contrôle de la réplication chez Vibrio. Cela aura un impact considérable sur nos connaissances fondamentales de la réplication de l'ADN et de la maintenance du génome chez les bactéries. Les bactéries possédant plusieurs réplicons pourraient partager des stratégies similaires, conservées au cours de l'évolution, de coordination temporelle de la réplication. Nos résultats permettront d'établir un modèle de coordination de la réplication chez les bactéries à génomes multipartites.

- manuscrit en cours de révision

Le projet RepliChroms vise à décrypter les mécanismes d'adaptation des plasmides chez leur hôte bactérien. Les génomes bactériens sont composés de deux types de réplicons : les chromosomes qui sont par définition essentiels et les plasmides qui sont dispensables. Les bactéries ont généralement un seul chromosome circulaire et les modèles actuels de la dynamique du génome bactérien sont basés sur cette hypothèse. Cependant, 10% des bactéries ont aussi des chromosomes secondaires dérivant de mégaplasmides. Les chromosomes secondaires et les mégaplasmides, appelés « chromides » confèrent des caractères spécifiques à leurs hôtes (ex. pathogénicité, résistance). Les plasmides entrants sont souvent mal adaptés à leurs nouveaux hôtes et leur stabilisation nécessite une intégration avec les mécanismes cellulaires de l’hôte selon un processus appelé domestication. Le projet RepliChroms se concentrera sur l'identification des mécanismes fondamentaux responsables de la domestication des chromides chez les bactéries, avec une description détaillée de leur processus de réplication.

Les Vibrios constituent un groupe important et abondant de bactéries dans les écosystèmes aquatiques, comprenant à la fois des symbiotes et des agents pathogènes pour de nombreux organismes aquatiques. Tous les Vibrios possèdent un chromosome (Chr1) et un chromide (Chr2). Une grande partie du projet RepliChroms sera entreprise chez Vibrio cholerae, un agent pathogène d'importance mondiale et les conclusions de nos expériences devraient être valides et généralisées pour toutes les espèces de Vibrio. Nous avons récemment découvert comment Chr2 synchronise sa réplication avec Chr1. L'initiation de la réplication de Chr2 est déclenchée par la réplication d'une séquence intergénique (crtS) située sur le Chr1. Ce point de contrôle est un moyen élégant et économique pour les chromides d’harmoniser leur réplication avec le système bien établi de régulation de la réplication du chromosome de l’hôte. RepliChroms permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires synchronisant la réplication du Chr2 de V. cholerae.

Au cours de la dernière décennie, de nouveaux isolats virulents de Vibrio portant des chromides additionnels (Chr3) ont émergé. RepliChroms cherchera dans quelle mesure la réplication du Chr3 est intégrée au cycle cellulaire de l’hôte bactérien. Cela aidera à comprendre les mécanismes d'évolution des génomes qui contribuent à l'émergence de nouveaux Vibrios pathogènes. RepliChroms étudiera plus avant le mode de réplication d'autres modèles bactériens dotés de génomes multipartites (par exemple Burkholderia et Agrobacterium) et fournira une description détaillée de la réplication coordonnée de leurs chromides. Le fait que des chromides supplémentaires soient conservés après spéciation sur de nombreux genres bactériens en tant que chromosomes supplémentaires indique une caractéristique fondamentale de l'évolution, de l'adaptation et du pouvoir pathogène de nombreuses bactéries.
RepliChroms intégrera des techniques modernes, telles que la PCR digitale, la microscopie à fluorescence et le séquençage à haut débit, afin d'améliorer considérablement notre compréhension de la dynamique des génomes multipartites et d'ouvrir la voie à de nouvelles perspectives.