Dissection des processus moléculaires associés à la production de protéine recombinante chez P. putida. – CHEAP

Pour examiner les processus cellulaires lors de la production de protéines hétérologues, une approche systématique est proposée composée de cinq objectifs. L'entrée («charge métabolique«) est modulée par l'utilisation d'une collection de plasmides. Des données quantitatives sur différents niveaux cellulaires au cours de la production de protéines hétérologues seront systématiquement collectées avec un ensemble d'outils développés précédemment (métabolomique, fluxomique, dosage quantitative des éléments moléculaires impliqués dans l'expression des protéines dans différents systèmes (souches). Comme il n'est pas possible d'analyser en détail toutes les combinaisons possibles, les conditions les plus intéressantes et les plus prometteuses seront sélectionnées dans un processus de criblage. Toutes ces données entreront dans un modèle mathématique dans le but de pouvoir attribuer un «terme de coût spécifique à la protéine hétérologue« et de prédire le coût d'autres protéines.

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Pseudomonas putida est micro-organisme plateforme important pour les applications biotechnologiques contemporaines, car il combine une manipulation génétique aisée, un taux de croissance rapide avec une faible demande en nutriments et une résistance intrinsèque aux stress métaboliques et physiologiques. L'objectif général de ce projet est de développer une compréhension globale, à l’échelle du système, de la physiologie et du métabolisme de la surproduction de protéines hétérologues en utilisant P. putida comme organisme hôte. En effet, l'induction de la surproduction de protéines conduit à une modification profonde de l'allocation des ressources, des fonctions cellulaires normales vers la tâche supplémentaire demandée à la cellule hôte. Ces ressources comprennent non seulement les machineries transcriptionnelles et traductionnelles, dont l’ARN polymérase et les ribosomes, mais aussi l'énergie chimique et redox. Pour faire face à cette nouvelle distribution des ressources, c’est le métabolisme dans son ensemble qui doit s'adapter pour assurer la croissance, ou au moins la survie des cellules. Si cela échoue, ce qui signifie que l'une de ces ressources devient limitante, le taux de croissance généralement diminue et la production de la protéine hétérologue cesse. Ce phénomène est appelé «charge métabolique».
Dans le cadre du projet proposé, nous réaliserons une étude approfondie, à l’échelle du système, de la réponse métabolique à la production de protéines hétérologues chez P. putida. Avec une équipe interdisciplinaire de scientifiques issus de deux laboratoires en France et en Allemagne, nous allons collecter systématiquement des données quantitatives sur des cellules de P. putida qui génèrent une charge métabolique contrôlée. Par conséquent, une collection de plasmides sera créée (Objectif n ° 1) de sorte à moduler spécifiquement les différentes entrées qui informent sur la capacité cellulaire. De plus, nous développerons des constructions génétiques pour quantifier spécifiquement l'ARN polymérase et les ribosomes. Nous comparerons la réponse métabolique de la souche de type sauvage à celle d’une souche P. putida optimisée pour des productions biotechnologiques. Nous sélectionnerons ensuite les conditions les plus intéressantes et prometteuses (Objectif # 3), qui seront ensuite analysées en profondeur (Objectif # 4) avec des méthodologies expérimentales adaptées pour P. putida (Objectif # 2). La combinaison de ces approches conduira à une compréhension approfondie des processus cellulaires au cours de la production de protéines hétérologues aux différentes échelles cellulaires. Toutes ces données entreront dans un modèle mathématique qui prend en compte les spécificités et caractéristiques de la souche afin d’attribuer un coût spécifique à la production de protéine hétérologue et qui aura la capacité de prédire le coût pour la production d'autres protéines (Objectif # 5).
En résumé, les questions suivantes seront abordées dans le cadre de ce projet: Quel est le coût de production d'une protéine spécifique? Où sont les goulets d'étranglement au cours de la production de protéines hétérologues? Cette information peut-elle être généralisée et éventuellement prédite? Notre vision est de développer une boîte à outils qui nous permette de prédire l'environnement optimal pour un gène spécifique - ou éventuellement pour une voie métabolique - afin d’optimiser les performances de production.