ANR-DFG - Appel à projets générique 2018 - DFG

Dissection des interactions moléculaires de la glutarédoxine S15 mitochondriale chez les plantes – mitoglu

Dissection des interactions moléculaires de la glutarédoxine S15 mitochondriale chez les plantes

Plusieurs voies métaboliques et processus cellulaires des plantes dépendent du fonctionnement des protéines fer-soufre (Fe-S), dont les cofacteurs sont assemblés par des machineries d'assemblage dédiées présentes dans le cytosol, les plastes et les mitochondries. Les protéines Fe-S sont présentes dans les chaînes de transfert d'électrons photosynthétiques et respiratoires et sont nécessaires à l'assimilation du soufre et de l'azote, ou à la synthèse de coenzymes.

Le projet proposé vise principalement à disséquer le rôle de GRXS15 dans le transfert des centres Fe-S aux protéines cibles chez Arabidopsis.

La démonstration récente que GRXS15 peut lier un centre [2Fe-2S] en présence de glutathion et le transférer à un partenaire protéique, couplé à la caractérisation de mutants d’Arabidopsis thaliana (un mutant total est léthal au stade embryonnaire) pour le gène codant la GRXS15 mitochondriale a permis de démontrer que cette protéine est un constituant essentiel de la machinerie de transfert des centres Fe-S. Le projet proposé a donc pour but d'analyser précisément le rôle de la GRXS15 dans le transfert des centres Fe-S vers les protéines cibles chez Arabidopsis.

L'analyse biochimique, spectroscopique et structurale d’une holoprotéine GRXS15 obtenue par reconstitution in vitro et en anaérobiose permettra de déterminer l’état d’oligomérisation et la nature des centres Fe-S assemblés. Sur la base d‘alignements structuraux, des approches de mutagenèse dirigée et d’associations combinatoires de domaines seront dévelopées pour obtenir des nouvelles connaissances sur la relation structure-function de cette GRX et des protéines de la même classe. Les propriétés de ces variants seront déterminées (i) en analysant leur capacité à lier un centre Fe-S et sa labilité, (ii) en examinant finement les interactions protéine-protéine avec des protéines partenaires connues ou nouvellement identifiées, (iii) en réalisant une expression hétérologue dans un mutant de levure dépourvu de Grx5 mitochondriale et (iv) en évaluant leurs possibles propriétés redox en utilisant des tests d'activité in vitro avec la roGFP2 et des tests de sensibilité à l'oxydation.

Nous avons exprimé des protéines recombinantes étiquetées et non étiquetées dans E. coli sous leur forme pleine longueur ou tronquée dans la partie N-terminale. Il a été compliqué d'obtenir des formes de protéines solubles, non agrégées, avec un rendement suffisant. Pour cela, nous avons testé de nombreuses souches d'expression, conditions de culture et procédures de purification. Nous avons pu déterminer que le pKa de la seule cystéine 91 de AtGRXS15 était de 5,5. Cela indique qu'elle est probablement réactive et sensible à l'oxydation. Nous avons donc observé que H2O2 favorise la formation de dimères et que l'effet dépend de la concentration, et que GSSG et GSNO induisent la glutathionylation de la protéine. La capacité des thiorédoxines mitochondriales à réduire la GRXS15 oxydée a été déterminée in vitro. En purifiant les apo-formes, nous avons mis en place une procédure in vitro pour la reconstitution du cluster Fe-S dans GRXS15 en anaérobiose.
En ce qui concerne les analyses physiologiques, il convient de noter que les mutants nuls grxs15 d'Arabidopsis ne sont pas viables, mais que les mutants complétés par la variante GRXS15 K83A se développent avec un phénotype nain similaire à celui de la lignée knockdown GRXS15amiR. Dans une analyse métabolique des lignées GRXS15 variante et knockdown, nous avons montré que la plupart des processus dépendants des centres Fe-S ne sont pas affectés, c-à-d la biosynthèse de la biotine, la biosynthèse du cofacteur de molybdène, la chaîne de transport des électrons et l'aconitase dans le cycle TCA. Au contraire, nous avons observé une augmentation de la plupart des intermédiaires du cycle TCA et des acides aminés, en particulier le pyruvate, la glycine et les acides aminés à chaîne ramifiée (AACR). De plus, nous avons constaté une accumulation d'acides a-céto à chaîne ramifiée, les premiers produits de dégradation résultant de la transamination des AACR. Ces résultats pointent vers un défaut de synthèse d'acide lipoique.

Les prochaines étapes sont :
1) Mieux comprendre les caractéristiques structurales de GRXS15 d'Arabidopsis qui conditionnent le degré de complémentation du mutant grx5 de levure et son activité oxydoréductase.
2) Analyser plus en détail l'impact de la déficience de GRXS15 sur les enzymes mitochondriales et cytosoliques dépendantes du Fe-S et les conséquences physiologiques au niveau de la plante entière.
3) Disséquer le rôle de GRXS15 dans le transfert GSH-dépendant des centres vers les protéines acceptrices qui devront être identifiées.

1. Przybyla-Toscano J, Christ L, Keech O, Rouhier N. Iron-sulfur proteins in plant mitochondria: roles and maturation. J Exp Bot. 2021, 72(6):2014-2044. doi: 10.1093/jxb/eraa578.
2. Berndt C, Christ L, Rouhier N, Mühlenhoff U. Glutaredoxins with iron-sulphur clusters in eukaryotes - Structure, function and impact on disease. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2021, 1862(1):148317.
3. Moseler A, Kruse I, Maclean AE, Pedroletti L, Franceschetti M, Wagner S, Wehler R, Fischer-Schraderg K, Poscheth G, Wirtz M, Dörmann P, Hildebrandt TM, Hell R, Schwarzländer M, Balk J, Meyer AJ. The function of glutaredoxin GRXS15 is required for lipoyl-dependent dehydrogenases in mitochondria. Plant physiology in press

De nombreuses voies métaboliques et processus cellulaires chez les plantes dépendent du fonctionnement de protéines fer-soufre (Fe-S) dont les cofacteurs sont assemblés par des machines d'assemblage complexes présentes dans le cytosol, les plastes et les mitochondries. Pour ne citer que quelques exemples, les protéines Fe-S sont présentes au sein des chaînes de transfert d'électrons photosynthétiques et respiratoires et sont nécessaires à l'assimilation du soufre et de l'azote, ou à la synthèse de co-enzymes tels que la biotine et l'acide lipoïque. Chez les plantes comme chez les autres organismes, l'incorporation des centres Fe-S dans les protéines nécessite d'abord un assemblage de novo sur des protéines d'échafaudage puis leur transfert vers les protéines acceptrices grâce à l'action de plusieurs facteurs de maturation incluant les glutarédoxines (GRX) de classe II. La démonstration récente que GRXS15 peut lier un centre [2Fe-2S] en présence de glutathion et le transférer à un partenaire protéique, couplé à la caractérisation de mutants d’Arabidopsis thaliana (un mutant total est léthal au stade embryonnaire) pour le gène codant la GRXS15 mitochondriale a permis de démontrer que cette protéine est un constituant essentiel de la machinerie de transfert des centres Fe-S. Le projet proposé a donc pour but d'analyser précisément le rôle de la GRXS15 dans le transfert des centres Fe-S vers les protéines cibles chez Arabidopsis. L'analyse biochimique, spectroscopique et structurale d’une holoprotéine GRXS15 obtenue par reconstitution in vitro et en anaérobiose permettra de déterminer l’état d’oligomérisation et la nature des centres Fe-S assemblés. Sur la base d‘alignements structuraux, des approches de mutagenèse dirigée et d’associations combinatoires de domaines seront dévelopées pour obtenir des nouvelles connaissances sur la relation structure-function de cette GRX et des protéines de la même classe. Les propriétés de ces variants seront déterminées (i) en analysant leur capacité à lier un centre Fe-S et sa labilité, (ii) en examinant finement les interactions protéine-protéine avec des protéines partenaires connues ou nouvellement identifiées, (iii) en réalisant une expression hétérologue dans un mutant de levure dépourvu de Grx5 mitochondriale et (iv) en évaluant leurs possibles propriétés redox en utilisant des tests d'activité in vitro avec la roGFP2 et des tests de sensibilité à l'oxydation. Suite à nos travaux antérieurs, nous nous attendons à ce que des mutants déficients pour GRXS15 mais exprimant des variants de GRXS15 mutés ou des GRX d’autres organismes présentent des phénotypes physiologiques et de développement distincts. Ainsi, cela nous permettra d‘étudier si ces phénotypes sont liés à des défauts spécifiques de maturation de certaines protéines Fe-S et si un défaut dans le transfert des centre Fe-S au niveau de la mitochondrie occasionne des modifications qui ne toucheront que des protéines mitochondriales ou s'il affectera également les métalloenzymes cytosoliques. Cela est attendu du fait qu’un composé inconnu mais contenant du soufre d’origine mitochondriale est exporté pour la maturation des protéines cytosoliques et nucléaires mais aussi que la synthèse du cofacteur molybdène présent dans plusieurs enzymes Fe-S cytosoliques nécessite une enzyme Fe-S mitochondriale.

Coordinateur du projet

Monsieur Nicolas ROUHIER (UMR 1136 Interactions Arbres-Microorganismes - Université de Lorraine)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UL-IAM UMR 1136 Interactions Arbres-Microorganismes - Université de Lorraine
University of Bonn

Aide de l'ANR 185 220 euros
Début et durée du projet scientifique : avril 2019 - 36 Mois

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