Etude de la rupture de tolérance dans une maladie humaine autoimmune médiée par les lymphocytes B – Autoimmuni-B

Pour déterminer l'origine et le répertoire des clones B auto-réactifs contre la GPIIbIIIa, la cible plaquettaire principale, dans la rate de patients après reconstitution lymphocytaire B, le consortium utilisera des approches technologiques nouvelles. Cela impliquera
1) un nouveau système de culture in vitro en cellules uniques permettant de déterminer la spécificité contre la GPIIbIIIa et d'obtenir la séquence du BCR, pour les cellules mémoires et les cellules du centre germinatif.
2) un système innovant de microfluidique permettant l'identification des plasmocytes individuels spécifiques de la GPIIbIIIa, la détermination de leur affinité pour l'antigène, leur isolement et le séquençage de leur BCR. Les séquences ainsi obtenues permettront l'établissement de filiation clonales entre cellules du centre germinatif, cellules mémoires B et plasmocytes, et ainsi de fournir pour la première fois une vue globale d'une réponse auto-immune dans la rate humaine

- identification d'une sous-population mémoire B résistant au rituximab et présentant des caractéristiques uniques, lui permettant d'échapper à la déplétion B par l'acquisition d'un phénotype «dormant« et d'être réactivée lors de l'élimination de la drogue. Cette population résistante au rituximab est sensible à un ciblage par des anticorps anti-CD19 in vitro, ce qui ouvre de nouvelles possibilités thérapeutiques.
- Identification de plasmocytes spécifiques de la GPIIbIIIa dans différents compartiments lymphoïdes et présentant une vaste gamme d'affinité pour l'antigène

- Caractérisation du profil transcriptionnel de plasmocytes dans différents contextes pathologiques, sur la base d'échantillons appariés, sans, moelle et rate.
- Isolement de plasmocytes spécifiques de la GPIIbIIIa permettant l'analyse de leur répertoire en fonction de leur affinité pour l'antigène

«Rituximab-resistant splenic memory B cells and newly-engaged naive B cells fuel relapses in patients with immune thrombocytopenia«
Crickx, E., Chappert, P., Sokal, A., Weller, S., Azzaoui, I, Vandenberghe, A., Bonnard, G., Rossi, G., Fadeev, T., Storck, S., Fadjallah, J., Meignin, V., Rivière, E., Audia, S., Godeau, B., Michel, M., Weill, J.-C., Reynaud, C.-A. and Mahévas, M.
Sci. Transl. Med., in press (2021)

La question centrale de ce projet est de comprendre quel mécanisme de dérégulation survient dans les maladies auto-immunes et quelle est la contribution dynamique de chaque sous-population de cellules B dans ce processus. Nous tirerons profit d’un modèle unique dans lequel différents scénarios cliniques, au cours de la Thrombopénie Immunologique (PTI), illustrent des aspects fondamentaux multiples. En premier lieu, cette étude se focalisera sur les patients splénectomisés 6 mois après la déplétion B pour une rechute, ce qui offre l’opportunité d’étudier la maladie avant tout traitement avec un accès à l’organe cible (la rate) et permet d’explorer les différents événements de rupture de tolérance. Pour déterminer, dans la rate des patients PTI, l’origine et le répertoire après reconstitution lymphocytaire B des clones B anti-GPIIbIIIa (principal antigène plaquettaire), ce projet utilisera de nouvelles approches qui combineront 1) un nouveau système de différentiation de cellules B permettant de tester la spécificité et d’obtenir les séquences VH des cellules B mémoires et des centres germinatifs en cellule unique 2) des systèmes de microfluidique innovants permettant l’identification, la caractérisation, le tri et le séquençage des plasmocytes (PC) anti-GPIIbIIIa. Les séquences anti-GPIIbIIIa spécifiques seront alors confrontées aux données obtenues par séquençage à haut débit afin d’identifier des relations clonales dans les cellules B mémoires, du centre germinatif et des PC, fournissant pour la première fois une vision globale d’une réponse auto-immune dans la rate humaine.
Les rechutes observées après déplétion B durant le redémarrage de la lymphopoïèse B suggèrent un défaut de sélection négative des clones auto-réactifs. A quelle étape du développement B survient la rupture de tolérance contre les antigènes plaquettaires, et si ce mécanisme est restreint ou non aux antigènes plaquettaire est la seconde question de ce projet. Pour étudier les points de contrôle de tolérance du développement B, nous utiliserons notre systéme de culture en cellule unique, pour tester la polyréactivité (anti-dsDNA, insuline, LPS) et l’autoréactivité contre les antigènes plaquettaires dans les cellules B immatures (tolérance centrale) et les cellules B naïves (tolérance périphérique) dans la rate des patients PTI et des donneurs sains. Une des hypothèses est que l’excès de BAFF qui est observé dans le sérum et dans la rate après déplétion B pourrait modifier le seuil de sélection négative des cellules B autoréactives nouvellement formées. Ceci sera aussi testé dans les cellules sanguines des patients au cours d'un essai prospectif dans lequel la déplétion B (Rituximab) est réalisée en présence ou non d’un anticorps anti-BAFF (Belimumab) jusqu’à la reconstitution B.
Enfin, l’environnement autoimmun pourrait induire des modifications intrinsèques des plasmocytes (PC). Les plasmocytes spléniques des patients PTI ont, dans leur ensemble, une signature transcriptionnelle particulière, mais il n’était pas jusqu’à ce jour possible de lier la spécificité antigénique à un profil transcriptionnel. Pour comparer des populations pures de PC, nous étudierons la moelle osseuse de patients, 6 mois après splénectomie et Rituximab. En utilisant un système de double détection des PC anti-GPIIbIIIa et anti-tétanos, le consortium réalisera une analyse de RNAseq en cellule unique après tri cellulaire. L’analyse de ces PC spécifiques, en l’absence de cellules B mémoires, donnera une signature unique de PC à longue durée de vie générés dans une réponse immune chronique. Ce projet aidera à comprendre les mécanismes fondamentaux qui conduisent à la rechute et à la rupture de tolérance dans un modèle de maladie auto-immune médiée par les anticorps et donnera l’opportunité unique d’étudier la signature moléculaire des plasmocytes pathogéniques. Ceci pourrait aider à développer de nouveaux marqueurs et de nouvelles cibles thérapeutiques.