Mécanismes du pattern lipidique du réseau trans-Golgien (trans-Golgi Network) et rôles dans le tri des protéines, la polarité cellulaire et le développement des plantes – caLIPSO

Le TGN est divisé en sous-populations qui peuvent se chevaucher lorsqu’on les observe en microscopie confocale traditionnelle, nous utilisons le microscope à haute résolution Zeiss 880 équipé d’un module airyscan rapide qui permets de combiner 100 nm de résolution en X-Y et une vitesse d’acquisition rapide de 100 ms. Ceci nous permets d’observer la dynamique des compartiments intracellulaires marqués par les PIPs et d’analyser leurs interactions avec d’autres compartiments. Pour identifier et quantifier les lipides au TGN, nous utilisons des techniques d’immuno-purification de TGN sans détergents. Le partenaire 1 a montré que l’identification et la quantification des lipides est possible dans des purifications de TGN et d’appareil de Golgi. Pour cela nous combinons la purification de membranes par centrifugation sur gradient de densité avec une approche GFP-trap sur billes magnétiques couplées à des anticorps anti-GFP, le rendement de purification est excellent avec très peu de bruit de fond. Par LC-ESI-MS nous travaillons sur un protocole pour détecter les PIPs mais aussi les autres classes de phospholipides. Ceci combiné avec des analyses par HPTLC couplée à la GC-MS nous permettra d’obtenir des informations détaillées sur la nature de la tête polaire, la longueur des chaînes acyles, le degré de saturation et d’hydroxylation. Sur les fractions immuno-purifiées nous réalisons également des analyses de protéomique quantitative en utilisant la technique du label-free. Pour précisément cibler les PI4P au TGN, nous construisons un système de dimérisation inductible à la rapamycine pour recruter au TGN la protéine Sac1, une phosphatase spécifique des PI4P de Saccharomyces cerevisiae. Afin de réaliser cet objectif, nous fusionnerons le domaine FKBP à Sac1. Pour cibler spécifiquement la construction au TGN nous utiliserons les mêmes marqueurs que ceux que nous utilisons pour les immuno-purifications car leurs localisations ont été largement étudiées.

Les résultats du partenaire 1 ont permis de mettre en évidence que la longueur des chaînes acyles des SLs est cruciale dans la régulation de l’homéostasie des PIPs au TGN. Nous avons identifié un acteur protéique impliqué dans ce processus, une phospholipase C (PLC) spécifique des PIPs (PI-PLC). Les PI-PLC consomment le PI4P en le clivant et en produisant d’un côté une molécule de diacylglycerol (DAG) qui chez les plantes est rapidement converti en phosphatidic acid (PA), et d’un autre côté un inositol polyphosphorylé. Nous avons montré par approche pharmacologique et génétique couplée à une approche biochimique que la fonction de PI-PLC est nécessaire pour réguler la quantité de PI4P au TGN en aval des SLs. De plus nous avons mis en évidence que la relation homéostatique SLs/PI4P est primordiale lors du trafic sécrétoire polarisé du transporteur d’auxine PIN2 du TGN au domaine polaire apical de la membrane plasmique des cellules épidermiques de la racine. PIN2 est impliqué dans la redistribution de l’auxine et la réorientation de la croissance racinaire lors d’un stimulus de changement d’axe de gravité (gravitropisme). Nos résultats montrent qu’un double mutant impacté dans la production de PI4P au TGN est insensible à l’effet provoqué par une modification de la composition en SLs sur le gravitropisme. Ces résultats montrent que le PI4P est bien un acteur en aval des SLs d’un point de vue fonctionnel lors d’une réponse phénotypique. Le partenaire 2 s’est concentré sur les enzymes qui consomment le PI4P, non pas en le clivant comme dans le cas de PI-PLC, mais en le déphosphorylant ce qui résulte en la production de phosphatidylinositol (PI). Les enzymes déphosphorylant le PI4P sont SAC6, SAC7 et SAC8. L’équipe étudie la localisation intracellulaire des enzymes SAC6-8 ainsi que leur fonction dans l’homéostasie du PI4P, le trafic endomembranaire, le tri des protéines et le développement des plantes.

Les avancées produites par les deux équipes sont très complémentaires et ont permis d’identifier deux mécanismes de régulation du PI4P au TGN, l’un par l’intermédiaire des SLs et de PI-PLC, l’autre par l’intermédiaire des phosphatases SACs. Dans les cellules animales, la tête polaire des SLs modulent les mécanismes d’échanges du PI4P entre réticulum endoplasmique et TGN, régulant ainsi la quantité de PI4P au TGN. Les données obtenues par le partenaire 1 montrent que la longueur des chaînes acyles des SLs modulent la quantité de PI4P au TGN par l’intermédiaire des PI-PLCs. Il serait donc intéressant dans le cadre de ce projet de tester l’implication de la tête polaire des SLs dans la régulation de la quantité de PI4P au TGN médiée par les enzymes SACs et potentiellement des mécanismes d’échanges de lipides au niveau de sites de contact membranaires. De manière intéressante, l’ajout de la tête polaire des SLs s’effectue au TGN et le partenaire 1 a développé les outils génétiques permettant de tester cela fonctionnellement. Dans la prochaine période nous testerons donc l’implication de la tête polaire des SLs dans la voie de régulation dépendante des SACs. Plus généralement, nous testerons le rôle des deux voies dans le tri des protéines, en particulier le tri sécrétoire et endocytique des transporteurs d’auxine. Cela nous permettra d’apporter des éléments de réponse sur comment le TGN tri et différencie la sécrétion et l’endocytose au sein d’une même structure.

1. Ito Y#, Esnay N#, Platre M, Noack L, Menzel W, Claverol S, Moreau P, Jaillais Y, Boutté Y*. Sphingolipids mediate polar sorting of PIN2 through phosphoinositide consumption at the trans-Golgi Network. Nature Communications (revision)

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Le tri des protéines est un processus crucial des cellules eucaryotes qui permet de coordonner les voies de sécrétion et d’endocytose à travers le trans-Golgi Network (TGN) et les endosomes précoces (EEs), respectivement. Bien qu’un couplage entre ces deux systèmes existe, ces structures ont évoluées différemment au sein des règnes eucaryotes. Les plantes ont développées un TGN singulier qui floute à l’extrême la frontière entre sécrétion et endocytose. Notre projet propose de comprendre comment le TGN arrive à fusionner au sein d’une même entité d’une rare complexité deux plateformes majeures de tri des cellules eucaryotes, le TGN et les EEs. Le TGN des plantes est différentié en sous-domaines. Les vésicules de sécrétion (SVs) et les vésicules à manteau de clathrine (CCVs) représentent deux sous-domaines distincts du TGN qui régulent le tri vers la membrane plasmique (PM) et les endosomes tardifs, respectivement. Cependant, bien que certaines protéines aient été identifiées spécifiquement aux sous-domaines du TGN, les lipides n’ont pas été beaucoup étudiés alors qu’il apparaît de plus en plus évident qu’ils sont des déterminants clés de l’identité membranaire et des mécanismes de tri. Nous avons précédemment montré une concentration en sphingolipides (SLs), stérols (partenaire 1-P1, Yohann Boutté) et phosphoinositides (PIPs) (partenaire 2-P2, Yvon Jaillais) dans des sous-domaines du TGN et nos données préliminaires suggèrent que les patrons lipidiques de SLs et de PIPs sont interconnectés. En combinant des approches de pointe en lipidomique et biologie cellulaire et développementale, nous allons identifier la répartition lipidique au TGN, déterminer les mécanismes impliqués et caractériser leur importance dans le tri des protéines, la polarité cellulaire et le développement racinaire. Dans la tâche 1 (P1) nous cartographierons la localisation subcellulaire précise des PIPs aux sous-domaines du TGN par microscopie à haute résolution de marqueurs fluorescents de PIPs établis par le partenaire 2 et nous réaliserons des analyses en lipidomique sur les sous-domaines du TGN que nous immuno-purifierons. De plus, nous étudierons l’impact d’une altération pharmacologique et génétique de la composition en SLs sur les patrons de localisation des PIPs et la morphodynamique du TGN. Dans la tâche 2 (P2) nous établirons une nouvelle approche de biologie cellulaire afin d’effacer le PI4P de manière ciblée aux sous-domaines du TGN. Pour cela nous introduirons le système de dimérisation inductible à la rapamycine dans Arabidopsis. Nous utiliserons cet outil pour étudier l’impact des PI4P sur la morphodynamique du TGN, le tri protéique et pour identifier les protéines et lipides en aval. Dans la tâche 3 (P1, P2), nous déterminerons la fonction de l’interconnexion SLs/PIPs dans la maturation des sous-domaines du TGN et le tri protéique du TGN à la PM en utilisant des outils de pointe en microscopie. Dans cette tâche, P1 et P2 combineront leurs expertises des SLs et des PIPs pour disséquer des mécanismes moléculaires impliqués dans le patron de localisation des PIPs au sein du système endomembranaire. L’identification de ces mécanismes ouvrira la voie pour comprendre comment les lipides agissent dans la différentiation du TGN et ainsi dans le trafic subcellulaire de PIN2, un transporteur d’efflux d’auxine qui est localisé de manière polaire à la PM apicale des cellules épidermiques de la racine et qui régule la réponse racinaire à la gravité (courbure de la racine suivant la gravité). En conclusion, ce projet met en place un dispositif unique et innovant en combinant des compétences complémentaires. L’élucidation de la fonction et de la dynamique de l’interaction entre SLs et PIPs lors du tri sélectif de protéines au niveau du TGN représente un nouveau point d’entrée pour comprendre comment les patrons lipidiques différentient les sous-domaines du TGN et conditionnent les événements de tri protéiques lors de la sécrétion et de l’endocytose.