CE12 - Génétique, génomique, ARN

Mécanisme de la recombinaison mitotique et méiotique – CreaDiv

Comment les cellules créent-elles de la diversité génomique?

Certaines de nos cellules (germinales, neurones, lymphocytes, tumeurs) sont capables de faire évoluer rapidement tout ou partie de leur génome. Les mécanismes impliqués sont encore mal connus. Notre projet vise à identifier certains de ces mécanismes dans le système modèle levure, en particulier le rôle de la phosphorylation de l'ADN polymérase alpha dans la recombinaison mitotique et méiotique.

Régulation de la recombinaison mitotique et méiotique par phosphorylation de l'ADN polymérase alpha.

Le génome est normalement répliqué pendant la phase S du cycle cellulaire. Certaines régions du génome sont naturellement répliquées tardivement, et sujettes à une évolution plus rapide. Nous avons découvert que cette situation est amplifiée dans les cellules tumorales et dans des mutants de levure ayant une capacité réduite à former des origines de réplication compétentes. Ces cellules ont des taux élevés de remaniements chromosomiques, et leur survie dépend du passage d'un mode de réplication normal vers un mode dépendant de la recombinaison (BIR) pour terminer la duplication de leur génome. <br />Nous avons identifié une étape clé de ce basculement, qui est la phosphorylation de l'ADN polymérase alpha à l'entrée en mitose. De façon très intéressante, cette phosphorylation semble aussi requise pour la gamétogenèse chez la levure, très probablement au stade de la recombinaison méiotique. <br />L'objectif de ce projet est d'identifier les étapes précises de la recombinaison nécessitant la phosphorylation de l'ADN polymérase alpha. Nous utilisons pour cela l'archétype de la recombinaison méiotique chez la levure, pour laquelle des essais moléculaires existent pour disséquer chacune des étapes. Les facteurs nécessaires à la synthèse d'ADN requise pour réparer les cassures double-brin méiotiques seront également étudiés. <br />Grace à l'emploi d'un système génétique permettant de contrôler l'amplitude de la réplication tardive des chromosomes, nous identifierons par séquençage massif les zones de réplication mitotique ainsi que tous les intermédiaires de recombinaison non productifs générés.

Une technique permettant d'obtenir des populations hautement synchronisées en méiose a été développée et adaptée au laboratoire.
L'état de phosphorylation de l'ADN polymérase alpha a été analysé par mobilité électrophorétique et par spectrométrie de masse, au cours de la progression méiotique de populations cellulaires synchronisées.
Des mutants non-phosphorylables de l'ADN polymérase alpha (Pol1 et Pol12) ont été générés et transférés dans les fonds génétiques requis.
La progression méiotique (MI, MII, sporulation) a été suivie par microscopie dans les divers mutants.
Une technique de précipitation et séquençage (EdUseq) des fragments d'ADN synthétisés pendant la recombinaison méiotique a été développée, puis utilisée pour comparer divers mutants de gènes ayant été impliqués dans ces processus.
La méthode de séquençage de longues molécules d'ADN (nanopore seq) a été implémentée au laboratoire pour analyser les remaniements chromosomiques.

Nous avons pu démontrer que:
1. l'ADN polymérase alpha est hyperphosphorylée à l'entrée de prophase I jusqu'en fin de MII
2. ce changement de mobilité électrophorétique est maintenu dans un mutant ndt80?, excluant la contribution des Clb1,3-Cdk1 et Cdc5/Plk1 dans la phosphorylation méiotique, contrairement à ce qui a été observé en mitose.
3. la pénétrance des phénotypes causés par l'élimination des sites putatifs de phosphorylation par les CDK dépend de la souche et des conditions de sporulation utilisées, suggérant l'existence d'autres sites de phosphorylation
4. l'analyse par spectrométrie de masse a permis d'identifier de nouveaux sites de phosphorylation, dont les mutants sont en cours de construction.
5. les protéines Exo1, Msh4, Pol32 et Pif1 sont toutes requises pour une synthèse d'ADN efficace suite à la CDB méiotique.
6. la viabilité de cellules n'ayant pas répliqué l'intégralité de leurs chromosomes au moment de l'entrée en mitose dépend des gènes RAD52, POL32 et MUS81/YEN1

Nous espérons que l'addition de mutations éliminant de nouveaux sites de phophorylation de l'ADN polymérase alpha donnera des phénotypes plus tranchés en méiose, ouvrant alors la voie à la caractérisation des défauts précis de la recombinaison méiotique liés à l'absence de phosphorylation. Ceci mettra en évidence une nouvelle étape de régulation de ce processus clé pour la réparation des cassures double-brin et des fourches de réplication collapsées, moteurs dans l'évolution des génomes.

Deux articles en rédaction

La recombinaison est vitale pour réparer les cassures double-brin de l'ADN, qu'elles soient pathologiques comme lors de l'exposition à des agents clastogènes (irradiation, produits chimiques) ou programmées comme dans le cas de la méiose pour la formation des gamètes. La recombinaison permet aussi de redémarrer les fourches de réplication arrêtées, et fait d'ailleurs partie intégrante de la duplication des génomes chez les phages et bactéries. Chez les eucaryotes, la réplication des chromosomes est organisée de telle sorte que, avec des origines de réplication multiples et un système de surveillance des fourches bloquées, la synthèse d'ADN soit complète avant l'entrée en mitose. Ce point est primordial pour la bonne ségrégation des chromosomes en mitose, et le maintien de l'intégrité génomique. Cependant, sur des échelles de temps longues, pour l'adaptation à des stress ou dans la genèse des cancers, il est important que les génomes puissent évoluer, créer de la diversité pour mieux s'adapter. Les régions chromosomiques qui répliquent le plus tardivement au cours du cycle cellulaire sont aussi celles qui évoluent le plus rapidement, suggérant l'existence de mécanismes mutagènes agissant en mitose sur ces régions. En effet, les fourches de réplication effondrées sont réparées par BIR (break-induced replication) et responsables de l'hyper-mutation, de pertes d'hétérozygotie et de remaniements chromosomiques dans les tumeurs, mais aussi lors de la diversification neuronale.

Nous avons mis au point un système permettant de créer, chez la levure, des zones de réplication tardives sans activer les mécanismes de surveillance qui inhibent l'entrée en mitose. Etonnamment, nous avons vu que les cellules entrent alors en mitose avant d’avoir fini de répliquer leur génome, puis terminent cette réplication en utilisant des mécanismes de recombinaison, comme chez les phages ou bactéries. Nous avons caractérisé ces mécanismes et identifié un composant de la fourche de réplication qui, lorsqu'il est phosphorylé par les kinases mitotiques, stimule le BIR mais crée aussi des remaniements génomiques importants. Curieusement, la phosphorylation de cette protéine essentielle de la réplication est requise aussi pour la recombinaison méiotique, identifiant donc un nouvel élément du contrôle de la recombinaison mitotique et méiotique.

L’objectif de ce projet de recherche est d'identifier l'étape précise, commune au BIR et à la méiose, catalysée par cette réaction. Pour cela, les laboratoires des deux partenaires mettront en commun leurs compétences et outils très complémentaires. Nous utiliserons un système permettant l'induction synchrone de la méiose et la détection physique des intermédiaires de recombinaison. Nous identifierons les protéines responsables de la synthèse de l'ADN recombiné et les facteurs contrôlant cette étape clé pour le choix du résultat de la recombinaison grâce à un système expérimental de détection de l'ADN nouvellement synthétisé lors de la recombinaison. En ce qui concerne la recombinaison mitotique par BIR, nous identifierons sa régulation et le spectre complet des remaniements chromosomiques produits, productifs ou non, avant leur sélection. Pour cela, nous utiliserons la nouvelle technique de séquençage sur nanopores, qui a la particularité de pouvoir lire des molécules d’ADN de plusieurs centaines de kilobases, et donc d’identifier des remaniements chromosomiques complexes, comme ceux produits par chromothripsis dans les tumeurs.

Nous sommes confiants que ce projet permettra de mieux éclairer les mécanismes mis en œuvre, en mitose et méiose, pour créer la diversité génétique permettant l’évolution des génomes.

Coordinateur du projet

Monsieur Etienne SCHWOB (Institut de génétique moléculaire de Montpellier)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IGMM Institut de génétique moléculaire de Montpellier
IC INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE

Aide de l'ANR 421 779 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2018 - 36 Mois

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