CE12 - Génétique, génomique, ARN

Cohésion des Chromosomes Frères dans la Bactérie – BaCh

Cohésion des chromosomes dans la bactérie

La réplication, la ségrégation des chromosomes et la division cellulaire doivent être coordonnées pour assurer la stabilité du matériel génétique. Chez les bactéries, les loci nouvellement répliqués migrent vers des moitiés de cellules opposées. Des observations microscopiques pionnières ont montré qu'il y a un décalage de quelques minutes entre le moment de la réplication et la ségrégation des copies. nous appellerons ce phénomène la cohésion bactérienne des sœurs chromatides (bSCC).

Comprendre la cohésion des chromatides soeurs chez les bactéries

À proprement parler, les bactéries n'ont pas d'orthologie de cohésions. Toutefois, par analogie avec les eucaryotes, nous appellerons ce phénomène «cohésion des sœurs chromatides bactériennes« (bSCC). D'autres études ont suggéré que la bSCC résultait de liens de caténation derrière les fourches de réplication. La plupart des bactéries possèdent deux topoisomérases de type II, la TopoIV et l'ADN gyrase. L'ADN gyrase élimine les supercoils positifs qui se forment en amont des polymérases. La TopoIV agit derrière les fourches de réplication (RF) pour éliminer les liens de précaténation induits par la rotation des RF face aux plectonèmes.L'objectif principal de la bach est de caractériser le déterminant de la bSCC et la conséquence de la bSCC sur la gestion des chromosomes dans les cycles cellulaires normaux et pathologiques.

Le projet BaCh a été divisé en trois lots de travail complémentaires (WP), l'exploration de la bSCC tout au long du génome de E. coli et V. cholerae dans diverses conditions de croissance et l'identification des facteurs bSCC qui contribuent à la formation de zones à forte concentration de bSCC (WP1), la caractérisation moléculaire du mécanisme d'action des facteurs bSCC identifiés (WP2) et l'impact de la perte de bSCC sur l'organisation et la dynamique de ségrégation du génome, le programme de réplication et la stabilité des fourches de réplication et de la réparation par recombinaison (WP3).

La cohésion des chromatides-sœurs décrit l'association ordonnée de molécules d'ADN nouvellement répliquées derrière des fourches de réplication. Elle joue un rôle essentiel dans le maintien et la transmission fidèle de l'information génétique. Elle est créée par les liaisons topologiques de l'ADN et les ponts protéiques, dont la formation et le dépôt pourraient être potentiellement affectés par de nombreuses protéines différentes de liaison à l'ADN. Cependant, il manquait un moyen d'analyser les variations locales de la durée de la cohésion sur l'ensemble d'un génome. Le groupe de FX Barre a développé une méthodologie à haut débit pour surveiller les contacts des chromatides sœurs (Hi-SC2), et montrer qu'elle permet d'analyser les variations spécifiques au locus de la cohésion des chromatides sœurs sur toute la longueur des chromosomes. Cette méthode est disponible sur BioRxiv (https://doi.org/10.1101/2019.12.17.879379).

Nous avons récemment démontré que pendant la réparation des lésions de l'ADN générées par la MMC, l'induction de la protéine RecN bloque la ségrégation des chromatides sœurs et finit par inverser le processus de ségrégation pour fusionner les loci déjà ségrégés. Pour comprendre l'événement moléculaire en jeu au cours de ce processus, nous avons réalisé des expériences Co-IP avec des anticorps RecN et analysé les protéines co-immunoprévues par spectrométrie de masse. Un petit ensemble de protéines connues pour leur implication dans la réparation de l'ADN a été identifié dans cet écran. Parmi elles, nous avons identifié RecA dont l'interaction avec RecN a déjà été démontrée chez E. coli (Vickridge et al 2017) et D. radiodurans. Nous avons également identifié les protéines UvrA, UvrB et UvrC impliquées dans la réparation par excision de nucléotides et RadA, une hélicase putative dont le rôle in vivo pendant la réparation est mal caractérisé.

Le WP2 est consacré à la caractérisation des mécanismes moléculaires impliqués dans la bSCC. La première année du projet a été consacrée à la purification des protéines RecN fonctionnelles. Cette tâche a été menée par le groupe de M. Modesti. Nous avons obtenu de la RecN soluble, mais nous n'avons pas encore pu obtenir une protéine fonctionnelle pour les essais in vitro. Néanmoins, ces protéines solubles ont pu être utilisées pour générer des anticorps spécifiques à la RecN (groupe O. Espeli) qui ont été extrêmement précieux pour les expériences développées dans le WP3. Nous avons réalisé l'optimisation des procédures AFM à grande vitesse pour la visualisation dynamique de RecN/RecA en solution. Les premières expériences réalisées en collaboration avec Félix Rico (Laboratoire Adhésion et Inflammation, Université d'Aix-Marseille) en utilisant le complexe humain. Nous travaillons actuellement sur l'optimisation des procédures de marquage fluorescent de la RecN/RecA.

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La prolifération cellulaire implique que les chromatides sœurs nouvellement répliquées soient tirées vers chacune des futures cellules filles. Chez les eucaryotes, la ségrégation n’arrive qu’une fois la phase S et la restructuration des chromosomes terminées. L’association des chromatides sœurs pendant les phases S et G2 est appelées Sister Chromatid Cohesion (SCC). La SCC est générée par les cohésines, un complexe multi protéique composé de protéines SMC (Structural Maintenance of Chromosome) et de leurs partenaires. Les cohésines sont déposées derrières les fourches de réplication durant la phase S. Chez les bactéries, réplication et ségrégation sont concomitantes. Les chromosomes bactériens ne contiennent qu’une seule origine de réplication bidirectionnelle qui définit deux brase de réplication. Alors que la réplication progresse le long des bras, les loci nouvellement répliqués migrent vers les pôles opposés de la cellule. L’observation de la ségrégation de loci individuels a démontré l’existence d’un délai de quelques minutes entre leur moment de réplication et le début de leur ségrégation. Pendant ce délai les chromatides sœurs sont en interaction. Bien que les bactéries ne disposent pas d’orthologue des cohésines nous appellerons cette étape de bacterial sister chromatid cohesion (bSCC). Les études réalisées dans différents laboratoires, incluant le groupe d’O. Espéli (Partner 1 du projet BaCh), ont suggéré que le délai de ségrégation était, en partie, causé par le temps pris par la topoisomérase IV pour enlever les liens de caténation formés à l’arrière des fourches de réplication. Nous avons récemment démontré, qu’en présence de cassures double brin de l’ADN, la SCC est dépendante de l’induction de la réponse SOS et plus particulièrement de l’activité de la protéine RecN. RecN est une protéine SMC, ce qui suggère que son action pourrait être similaire à celle des cohésines eucaryotes. La découverte de RecN comme facteur étendant la durée de la période de bSCC suggère que, comme chez les eucaryotes, la SCC est une étape importante du cycle cellulaire qui peut être régulée pour être adaptée à des conditions de croissances différentes. Ces observations ont conduit l’équipe de FX. Barre (Partenaire 3 de BaCh) à développer un nouvel outil d’étude de la bSCC à l’échelle du génome entier (Hi-SC2) et adaptable facilement à l’étude de changements environnementaux. Les premiers résultats obtenus avec Hi-SC2 révèlent que de nombreux facteurs de cohésion restent encore à découvrir, qu’ils pourraient agir dans des loci différents du chromosome, être régulés par les conditions de croissance ou avoir un fonctionnement diffèrent entre espèces bactériennes proches. Notre consortium poursuit trois objectifs dans le cadre de ce projet : (1) Identifier les facteur de cohésion de chromatides sœurs dans les génomes bactériens (E . coli et V. cholera) ; (2) caractériser leur mécanisme moléculaire et (3) comprendre leurs rôles dans le cycle cellulaire et les implications de leurs altérations. Pour atteindre ces objectifs BaCh s’appuie sur des méthodes modernes de génétique, génomique, imagerie et d’enzymologie à l’échelle de la molécule unique. Nous avons choisi de travailler simultanément sur deux modèles bactériens E . coli et V . cholera qui présentent des chorégraphies de ségrégation des chromosomes différentes mais restent suffisamment proches pour que l’on puisse à la fois identifier des règles spécifiques à chaque espèces et des mécanismes universels de contrôle de la cohésion des chromatides sœurs. Les concepts et les outils développés au cours de BaCh devraient également permettre d’alimenter les recherches sur l’étape de cohésion des chromatides sœurs chez les autres bactéries modèles et les eucaryotes.

Coordinateur du projet

Monsieur Olivier Espeli (Equipe Dynamique des Chromosomes (Centre interdisciplinaire de recherche en biologie))

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CIRB Equipe Dynamique des Chromosomes (Centre interdisciplinaire de recherche en biologie)
CNRS DR12 _CRCM Centre National de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse _Centre de recherche en cancérologie de Marseille
I2BC Institut de Biologie Intégrative de la Cellule

Aide de l'ANR 574 994 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2018 - 36 Mois

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