Système de détection fluorogénique/chimioluminogénique pour le suivi en temps réel de la production enzymatique d'oligonucléotides – LuminoManufacOligo

En matière de découverte de médicaments, de nouvelles approches visent à utiliser des entités chimiques (e.g., peptides, oligonucléotides oligosaccharides, ...) de taille intermédiaire entre les petites molécules biologiquement actives et les produits biologiques (protéines, anticorps). En effet, elles présentent souvent une bonne pénétration cellulaire et une grande affinité pour des cibles biologiques de grande taille. Dans ce contexte, et avec plus de 135 candidats-médicaments actuellement en essais cliniques, les oligonucléotides sont considérés comme les agents thérapeutiques du futur. L'intérêt pour ces biomolécules réside dans le fait qu'elles peuvent répondre à des besoins médicaux non satisfaits sous réserve que leur production à grande échelle soit possible. Cette dernière est actuellement réalisée selon des approches de synthèse en phase solide et en utilisant la chimie phosphoramidite. Cependant, en raison du large excès de réactifs/solvants utilisés et de la nécessité d'effectuer des purifications chromatographiques, ce procédé est peu viable économiquement et peu satisfaisant sur le plan environnemental. Une autre approche prometteuse repose sur une synthèse enzymo-catalysée mettant en jeu une polymérase pour relier les nucléotides les uns aux autres. Afin de confirmer l'efficacité de ce processus enzymatique, il serait très utile de disposer d'une méthode analytique indiquant en temps réel l'avancement de la réaction. Dans ce contexte, l'objectif de notre projet est de développer un outil "Process Analytical Tool" (PAT) pour la détection de l'ion pyrophosphate (PPi) libéré lors de la réaction catalysée par la polymérase. Les outils PAT font maintenant partie intégrante des processus de fabrication en raison des avantages qu'ils procurent en termes d'économie de temps, de réduction des coûts ainsi que de sécurité des procédés industriels. Leur disponibilité peut guider le choix d'un procédé par rapport à un autre et nous sommes convaincus que c'est un élément clé des technologies de production avancées, conduisant à des procédés durables et stimulant l'innovation et le renouveau industriel. Comme il sera difficile de différencier chimiquement PPi des dNTPs utilisés lors de la réaction enzymatique, nous proposons de le convertir (via une réaction enzymatique) en anion phosphate (Pi) plus réactif et donc plus aisément détectable. L'utilisation de sondes luminescentes "intelligentes" sélectives de l'analyte Pi devraient permettre de le détecter/quantifier. La première approche envisagée repose sur l'utilisation d'un pro-fluorophore synthétisé en protégeant la fonction aniline ou phénol d'un fluorophore par un motif réactif vis-à-vis de Pi. La fluorescence sera dévoilée seulement après la déprotection du centre fluorogénique de la sonde par cet analyte (détection fluorogénique de type "OFF-ON"). Comme il est souvent difficile d'éteindre totalement la fluorescence du fluorophore en masquant son centre fluorogénique, nous proposons également une seconde approche mettant en jeu des sondes de type "covalent assembly". Il s'agit de pre´curseurs "cage´s" qui sont convertis in situ en coeurs fluorescents, via des re´actions domino de´clenche´es par l'analyte cible´. Ils ne possèdent pas de fluorescence résiduelle et sont donc bien adaptés à notre application qui requiert une sensibilité de détection élevée. Toujours dans un souci de détecter Pi le plus efficacement possible, une troisième approche basée sur l'emploi de molécules chimiluminescentes (l'émission de lumière du chimiluminophore libéré après réaction avec Pi ne nécessite pas d'excitation photonique), sera également considérée. Nous évaluerons le potentiel de ces trois types de sondes pour la détection de Pi puis dans le contexte de la synthèse enzymo-catalysée d'oligonucléotides afin d'identifier les meilleurs candidats pour la mise au point de l'outil PAT utilisable dans des procédés industriels et des applications en bioanalyse des acides nucléiques.