CE07 - Chimie moléculaire, Chimie durable et procédés associés

Oligonucléotides mimes de protéases, Fonctionnalisation et Catalyse – PrOLIFiC

PROLIFIC

Protease-Like Oligonucleotides, Functionalization and Catalysis <br /> <br />Oligonucléotides mimes de protéases, Fonctionnalisation et Catalyse

Obtention d'oligonucléotides fonctionnalisés organisés par les structures secondaires de l'ADN

Ce projet vise à étendre le répertoire fonctionnel de l’ADN afin de catalyser des réactions biomimétiques, et en particulier à synthétiser des oligonucléotides fonctionnalisés (FuON), mimes nucléiques de protéases à serine telle que l'a-chymotrypsine. Cette enzyme a pour fonction d’hydrolyser la liaison peptidique grâce à une triade catalytique de trois acides aminés coopératifs, la sérine (Ser), l’histidine (His) et l’aspartate (Asp). <br />A partir d’une boite à outils de phosphoramidites convertibles ou portant déjà la modification mimantla chaîne latérale d' un des trois acides aminés impliqués, des oligonucléotides fonctionnalisés présentant une organisation modulable par les structures secondaires de l'ADN peuvent être obtenus par hybridation avec des brins complémentaires. Un positionnement précis et stable des groupements est assuré par le repliement contrôlé et reproductible de l’ADN qui permet un contrôle topologique à même de mimer au mieux le site actif des protéases à sérine. <br />Ces catalyseurs ADN seront ensuite assemblés en nanostructures de type tetraèdres d'ADN grâce aux capacités d’hybridation de l’ADN. <br />A chaque étape, les propriétés protéolytiques de ces catalyseurs ADN seront évaluées. <br />De tels mimes pourraient à terme permettre de développer des outils thérapeutiques innovants pour cibler des protéines pathogènes virales ou mal repliées.

Des librairies de FuON peuvent être obtenues suivant l’approche phosphoramidite en introduisant à des coordonnées précises au sein d’un oligonucléotide jusqu’à trois fonctionnalités (hydroxyle/imidazole/carboxylate). Pour ce faire, des phosphoramidites nucléotides convertibles en position 5' ont été incorporés pour être ensuite conjugués après synthèse sur support solide. Une seconde approche basée sur des phosphoramidites déjà fonctionnalisés est également en oeuvre pour introduire les trois modifications sur un seul oligonucléotide.
Puis ces derniers ont été organisés en structures non appariées flexibles de type bulge obtenues par hybridation avec des brins complémentaires modifiés ou non. Lorsque modifiés par un substrat ester ou amide chromogénique, ces brins complémentaires peuvent permettre d'hybrider les deux partenaires et d'évaluer par là-même les propriétés protéolytiques de ces FuON.

En s’appuyant sur l‘approche convertible, un tripode porteur des trois modifications a été introduit par ‘chimie click’. Les oligonucléotides fonctionnalisés sont alors structurés selon deux stratégies. La première consiste à varier la nature du brin complémentaire non modifié afin d’augmenter la diversité topologique des structures secondaires basées sur les FuON. La seconde cherche à augmenter la concentration effective en s’affranchissant du fait que les FuON ne possèdent pas de site de reconnaissance du substrat peptidique. Une approche covalente permet de mettre au contact le FuON portant le tripode avec un substrat chromogénique portant une fonction amide.

Cherchant à augmenter la diversité chimique des mimes de protéases à squelette nucléique afin de cribler pour un catalyseur fonctionnel, l’approche convertible et fonctionnalisée sont combinées pour développer une nouvelle famille d’oligonucléotides modifiés structurés en bulge.

Finalement, en se basant sur des aptamères sélectionnés pour reconnaître l’argininamide comme point de départ, des nucléotides en série thymidine présents dans la séquence peuvent être remplacés par des nucléotides convertibles pour conduire à des aptazymes à même d’hydrolyser les dérivés amides de l’arginine.

Les propriétés catalytiques de chaque FuON obtenu et structuré sont en cours d’évaluation. La faisabilité d’obtention de tétraèdres d’ADN (nanostructures développées pour des applications biologiques in vivo) décorés par des bulges porteurs de modifications est également à l’étude.

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Ce projet vise à étendre le répertoire fonctionnel de l’ADN afin de catalyser des réactions biomimétiques, et en particulier à synthétiser des oligonucléotides fonctionnalisés mimes nucléiques de protéases à serine, enzyme qui a pour fonction d’hydrolyser la liaison peptidique grâce à une triade catalytique de trois acides aminés coopératifs, la sérine (Ser), l’histidine (His) et l’aspartate (Asp). Des librairies de catalyseurs ADN peuvent être obtenues suivant l’approche phosphoramidite en introduisant à des coordonnées précises au sein d’un oligonucléotide (ON) jusqu’à trois fonctionnalités (hydroxyle/histamine/carboxylate) rappelant les chaine latérales des acides aminés (Ser), (His) et (Asp). Le positionnement précis et stable de ces groupements est assuré par le repliement contrôlé et reproductible de l’ADN qui permet un contrôle topologique à même de mimer au mieux le site actif des protéases à sérine. Pour ce faire, des phosphoramidites nucléotides convertibles ou déjà fonctionnalisés en position 5’ sur le sucre par différents liens (triazolo, amido ou amino) porteurs de la fonctionnalité correctement protégée ont déjà été ou seront synthétisés puis incorporés par synthèse supportée pour conduire à des ON fonctionnalisés. Leur séquence a été pertinemment choisie pour présenter une topologie modulable par les structures secondaires de l'ADN. En effet, ces ON fonctionnalisés peuvent s’organiser en structures non appariées flexibles (de type bulge, tige boucle, jonction 3 voies…) obtenues par hybridation avec des brins complémentaires modifiés ou non. La combinaison de ces différents phosphoramadites au sein de ces structures secondaires permettra d’obtenir des librairies hétérogènes de catalyseurs ADN couvrant un espace topologique suffisant pour espérer cribler un mime fonctionnel de protéases à sérine. Les capacités catalytiques de ces mimes nucléiques afin d’hydrolyser la liaison peptidiques seront ensuite évaluées sur des substrats chromogéniques de type ester et amide. Puis, les catalyseurs ADN 1D les plus prometteurs seront ensuite auto-assemblés au sein de structures bidimensionnels d’ADN ou tridimensionnelles de type tetrahédrons d'ADN, ceci étant rendu possible grâce aux propriétés d’hybridation de l’ADN. Cette approche permettra ainsi de multiplier le nombre de sites catalytiques pour augmenter l’efficacité de ces catalyseurs ADN. Il s’agit d’un nouveau glissement (voire rupture) dans l’utilisation de l’architecture de l’ADN, qui lui seul permet une double organisation de l’agencement local puis supramoléculaire de ses sites catalytiques pour réaliser l’hydrolyse de la liaison amide.

Coordinateur du projet

Madame Beatrice Gerland (SYNTHESE ET PHYSICOCHIMIE DE MOLECULES D'INTERET BIOLOGIQUE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

SPCMIB SYNTHESE ET PHYSICOCHIMIE DE MOLECULES D'INTERET BIOLOGIQUE

Aide de l'ANR 249 183 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2018 - 36 Mois

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