DS05 - Sécurité alimentaire et défi démographique

REGARD SUR L’AUTOPHAGIE MÉDIÉE PAR LES CHAPERONES CHEZ LES POISSONS – Fish-and-Chap

Regard sur l’autophagie médiée par les chaperonnes chez les poissons

L’Autophagie médiée par les chaperonnes (ou CMA pour Chaperone-Mediated Autophagy) est une voie majeure du catabolisme lysosomal. Selon l’idée actuellement admise, cette fonction cellulaire n’existerait que chez les mammifères ou les oiseaux, qui seraient les seuls à exprimer LAMP2A, une protéine nécessaire au fonctionnement de la CMA. Or, nous avons récemment mis en évidence l’existence de LAMP2A chez un certain nombre d’espèces de poissons, remettant ainsi en question ce point de vue.

Enjeux et Objectifs

Dans ce contexte, nous proposons de définir pour la première fois si l’apparition de cette fonction est antérieure à celle des mammifères et des oiseaux, et de déterminer le rôle physiologique de l’homologue de la protéine LAMP2A identifiée chez les poissons. Notre stratégie repose sur deux approches complémentaires. La première, consistera à caractériser le répertoire et l'expression des gènes impliqués dans la CMA chez un grand nombre d'espèces de poissons d'intérêt agronomique, écologique et scientifique. Le nombre croissant d’espèces de poissons dont le génome est entièrement séquencé et disponible ainsi que les progrès récents dans l’analyse du transcriptome permettent aujourd’hui d’inclure dans l’étude un grand nombre d’espèces de poissons. Ce premier axe permettra ainsi d’avoir une vision précise de l’étendue et de la nature des gènes potentiellement impliqués dans la CMA chez les poissons. La seconde approche visera à déterminer le rôle physiologique de l'homologue de lamp2a nouvellement identifié chez les poissons. Récemment, nous avons généré (grâce à l'outil d'édition du génome CRISPR-Cas9) une lignée mutante de medaka (Oryzias latipes) dont le variant d'épissage lamp2a du gène lamp2 est spécifiquement invalidée (lignée L2AKO). Dans ce second axe, nous effectuerons donc un phénotypage exhaustif de cette lignée L2AKO à différents niveaux (histologique, biochimique et moléculaire) afin de déterminer les conséquences métaboliques de l’invalidation de lamp2a et ainsi de confirmer l’existence d’une activité CMA fonctionnelle chez le medaka.

Analyses in silico : Recherche de séquences par Blast, analyses phylogénétiques et synthéniques

Analyse de l'expression des gènes : RT-qPCR

Analyse par Western blot

Histologie et microscopie électronique

Culture et transfection de lignées cellulaires de fibroblastes de Medaka

Procédures d'imagerie : Plate-forme photonique MRic (Centre d'imagerie Microscopique de Rennes) avec microscope haute résolution DeltaVision Elite (GE Healthcare)

Analyse statistique : Pour les comparaisons de plus de deux groupes, nous avons utilisé l'ANOVA unidirectionnelle avec un test post-hoc de Tukey (paramétrique) ou un test de Wilcoxon avec ajustement de Bonferroni. Pour comparer deux groupes, nous avons utilisé le test de Student t (paramétrique) ou le test de Kruskal-Wallis (non paramétrique) et le test de Wilcoxon (non paramétrique).

Nous démontrons que ce gène est apparu après la seconde duplication complète du génome survenue chez l'ancêtre commun des vertébrés il y a environ 500 millions d'années. L'analyse des génomes de plusieurs espèces de poissons a mis en évidence une conservation élevée de l'organisation génomique du gène LAMP2 chez les vertébrés. Enfin, l’analyse de l’expression des séquences génomiques identifiées révèle un profil d’expression tissulaire comparable à celui déjà publié pour Lamp2A chez la souris ou l’homme. Dans l'ensemble, ces premières données publiées dans le journal Autophagy ont permis de montrer, pour la première fois, l'existence et l'expression de Lamp2A dans différents tissus d'une grande variété d'espèces de poissons, suggérant ainsi que la CMA pourrait être apparue beaucoup plus tôt durant l'évolution qu’initialement suspecté.

Nous avons ensuite abordé la question de l’existence même d’une activité CMA chez les poissons. Pour cela, nous avons adapté à une lignée de fibroblastes de Medaka (Oryzias latipez), une méthode décrite pour mesurer l’activité de la CMA dans des cellules de mammifères (Koga et al., 2011). Les résultats obtenus démontrent clairement l’existence ainsi que l’induction d’une activité CMA dans les fibroblastes de medaka mis à jeun. Enfin, nous avons démontré que l’inactivation de lamp2a chez le medaka (par CrispR-cas9) entraîne des altérations sévères du métabolisme hépatique. Ces résultats, qui s’apparentent à ceux observés chez les souris dont LAMP2A a été invalidée (Schneider et al., 2014), démontrent ainsi une bonne conservation du rôle physiologique de cette protéine entre vertébrés.

Dans l'ensemble, ces résultats démontrent pour la toute première fois qu’il existe une activité CMA fonctionnelle chez les poissons et que cette fonction n’est pas restreinte au clade des tétrapodes.

Dans l’ensemble, ces données constituent une rupture dans la vision actuellement admise de l’histoire évolutive de la CMA. Elles ont déjà donné lieu à la publication d'un premier article dans la revue Autophagy et un deuxième article est en cours de révision dans Molecular Biology and Evolution. Selon les commentaires des reviewers, nous devrons effectuer de nouvelles expériences pour compléter le manuscrit. Nous chercherons également à caractériser les substrats protéiques de la CMA chez les poissons conformément à l'étape 4 de la tâche2 proposée dans le projet.

Publications dans des journaux internationaux à comité de lecture:

Lescat Laury, Herpin Amaury, Mourot Brigitte, Véron Vincent., Guiguen Yann, Bobe Julien, and Seiliez Iban. (2018). « CMA Restricted to Mammals and Birds?: Myth or Reality?? » Autophagy 14:1267–70


Communication dans des conférences internationales:

1. Laury Lescat, Amaury Herpin, Yann Guiguen, Julien Bobe, Iban Seiliez. Lamp2a in the light of evolution. 7th Scientific days on Autophagy, Nov 27-29. 2017, Paris (France) – Flash Talk + Poster
2. Laury Lescat, Brigitte Mourot, Vincent Véron, Karine Dias, Natàlia Riera, Yann Guiguen, Julien Bobe, Amaury Herpin, Iban Seiliez. On the existence of chaperone-mediated autophagy in fish. Keystone meeting on autophagy February 17-21 2019, Santa Fe, NM (USA) – Poster

Communication dans des conférences nationales:
1. Laury Lescat, Amaury Herpin, Yann Guiguen, Julien Bobe, Iban Seiliez. Lamp2a in the light of evolution. Deuxième journée de rencontre du Club d'Autophagie Bordelais. 11 Avril 2017. Bordeaux (France) – Oral
2. Laury Lescat, Amaury Herpin, Brigitte Mourot, Vincent Véron, Yann Guiguen, Julien Bobe, Iban Seiliez. Lamp2A à la lumière de l’évolution. Journées d’Animation Scientifique du département PHASE de l’INRA. 4-5 Avril 2018, Rennes (France) – Poster

L’Autophagie médiée par les protéines chaperonnes (ou CMA pour Chaperone-Mediated Autophagy) est une voie majeure du catabolisme lysosomal aujourd’hui considérée comme un acteur central de contrôle du métabolisme intermédiaire. Selon l’idée actuellement admise, cette fonction cellulaire n’existerait que chez les mammifères ou les oiseaux, qui seraient les seuls à exprimer LAMP2A, une protéine nécessaire au fonctionnement de la CMA. Or, nous avons récemment mis en évidence l’existence de LAMP2A chez un certain nombre d’espèces de poissons. Dans ce contexte, nous proposons de définir pour la première fois si l’apparition de cette fonction est antérieure à celle des mammifères et des oiseaux, et de déterminer le rôle physiologique de l’homologue de la protéine LAMP2A identifiée chez les poissons.
Notre stratégie repose sur deux approches complémentaires. La première, consistera à caractériser le répertoire et l'expression des gènes impliqués dans la CMA chez un grand nombre d'espèces de poissons d'intérêt agronomique, écologique et scientifique. Le nombre croissant d’espèces de poissons dont le génome est entièrement séquencé et disponible ainsi que les progrès récents dans l’analyse du transcriptome permettent aujourd’hui d’inclure dans l’étude un grand nombre d’espèces de poissons. Ce premier axe permettra ainsi d’avoir une vision précise de l’étendue et de la nature des gènes potentiellement impliqués dans la CMA chez les poissons et constituera ainsi un socle de connaissances indispensable dans de nombreux domaines liés à la biologie et à la physiologie des poissons tels que l'aquaculture, l'écologie et la toxicologie. La seconde approche visera à déterminer le rôle physiologique de l'homologue de lamp2a nouvellement identifié chez les poissons. Récemment, nous avons généré (grâce à l'outil d'édition du génome CRISPR-Cas9) une lignée mutante de medaka (Oryzias latipes) dont le variant d'épissage lamp2a du gène lamp2 est spécifiquement invalidée (lignée L2AKO). Dans ce second axe, nous effectuerons donc un phénotypage exhaustif de cette lignée L2AKO à différents niveaux (histologique, biochimique et moléculaire) afin de déterminer les conséquences métaboliques de l’invalidation de lamp2a et ainsi de confirmer l’existence d’une activité CMA fonctionnelle chez le medaka.
Pour mener à bien ce projet, le consortium est constitué de deux partenaires (l’UMR1419 NuMeA et l’UR1037 LPGP) présentant des compétences et expertises complémentaires. L'équipe ainsi constituée combine des connaissances scientifiques et techniques internationalement reconnues dans les domaines de l'autophagie, la génomique des poissons, l'édition des gènes et de métabolisme des poissons. Elle tirera profit des compétences scientifiques et techniques de chacun des membres pour faire avancer le projet. L'implication d'un doctorant dans ce projet (sous la direction des deux partenaires) renforcera également la cohésion du consortium.
Dans l’ensemble, ce projet qui ne semble pas présenter de risque technologique particulier, permettra de démontrer l’existence d’une activité CMA (non encore suspectée) chez les poissons. Ceci constituera ainsi une rupture dans notre compréhension des mécanismes de contrôle du métabolisme mais également de l’élaboration des tissues chez ces espèces à fort intérêt économique, patrimonial et scientifique. En outre, la comparaison de la « structure génétique » de la CMA entre espèces plus ou moins distantes phylogénétiquement nous apportera de précieux renseignements quant à l’histoire évolutive de cette fonction chez les vertébrés en général et chez les poissons en particulier. Enfin, les réseaux et partenariats des différents chercheurs impliqués dans ce projet assureront une diffusion efficace des résultats obtenus dans l'industrie aquacole ainsi qu’auprès des partenaires académiques.

Coordinateur du projet

Monsieur Iban Seiliez (UMR1419 NUMEA Nutrition, Métabolisme, Aquaculture ulture)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UR1037 LPGP Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons
UMR 1419 NUMEA UMR1419 NUMEA Nutrition, Métabolisme, Aquaculture ulture

Aide de l'ANR 309 391 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2018 - 36 Mois

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