Suivi site-sélectif et fidèle de modifications locales d'acides nucléiques en molécules uniques – SMFLUONA

De nombreux mécanismes cellulaires reposent sur des interactions dynamiques d'ARN ou d'ADN avec des protéines qui induisent des changements locaux et transitoires des acides nucléiques. Bien que la diffraction aux rayons X, la RMN ou la microscopie électronique fournissent des informations précieuses sur la structure des complexes protéine / acide nucléique, elles sont moins adaptées pour suivre leur dynamique, en particulier en solutions diluées. En raison de leur grande sensibilité, les techniques à fluorescence sont parfaitement adaptées pour atteindre cet objectif. Cependant, dans le cas des acides nucléiques, ces techniques souffrent du fait que les nucléobases naturelles ne sont pratiquement pas fluorescentes, de sorte qu’un marquage par des sondes externes souvent volumineuses est requis. Une avancée majeure a été réalisée par l'introduction de la thiénoguanosine (thG), un substitut de G, qui reproduit fidèlement le contexte structurel et la dynamique du nucléoside natif. En outre, thG reste fortement fluorescent lorsqu'il est incorporé dans des oligonucléotides (ODN) et présente des propriétés de fluorescence sensibles à l'environnement. thG devrait transformer la biophysique des acides nucléiques en permettant, pour la première fois, de suivre sélectivement et fidèlement les conformations et la dynamique d'un résidu G donné dans un ODN. Afin d'étendre les applications de cet analogue nucléosidique exceptionnel et de fournir pour la première fois des informations pertinentes sur les modifications locales et transitoires d’acides nucléiques au niveau de la molécule unique, l'objectif du projet SMFLUONA est de mettre en œuvre et d'appliquer des expériences de molécules uniques avec le thG. A cette fin, un des défis majeurs est d'augmenter la brillance et la photostabilité de thG. Ceci sera réalisé en utilisant les résonances de plasmon de surface de nanoparticules (NPs) d'Al et de Mg qui sont adaptées à l'absorption du thG (300-400 nm), mais nécessitent un contrôle précis de la distance sonde-NP. Ce contrôle sera réalisé en synthétisant des NPs d’Al et de Mg de taille et de surface contrôlées, puis en les greffant avec une stœchiométrie 1: 1 à des ODN de longueur appropriée marqués au thG ou en les positionnant avec précision par rapport à des ODN marqués au thG sur des origamis d’ADN. Pour valider notre approche, nous avons choisi de suivre les basculements de base lors de la réplication des patrons de méthylation de l'ADN par le tandem formé par l'ADN méthyltransférase 1 (DNMT1) et son guide, la protéine UHRF1 (Ubiquitin-like, PHD et RING). La méthylation des cytosines dans les sites CpG à des positions précises du génome fournit des marques épigénétiques clés permettant à une cellule d'exprimer un nombre défini de gènes qui déterminent l'identité de la cellule. Lorsque les cellules se multiplient, elles doivent transmettre fidèlement ces marques. Notre approche devrait fournir pour la première fois une image complète des basculements de base induits par SRA et DNMT1, ainsi que leur dépendance vis-à-vis du contexte de CpG, de la longueur d'ADN et de résidus protéiques clés. Notre approche aidera à résoudre une large gamme de questions biologiques impliquant des changements structurels locaux et transitoires d’ADN ou d’ARN. De plus, le déchiffrage du mécanisme des étapes de basculement de base dans la réplication de la méthylation de l'ADN par le tandem UHRF1 / DNMT1 devrait fournir de nouvelles pistes pour son éventuel blocage, ce qui devrait conduire à d'importantes applications thérapeutiques dans des pathologies telles que les cancers et maladies neurodégénératives où le profil de méthylation est modifié. Ce projet interdisciplinaire sera réalisé par deux partenaires d’expertises complémentaires en fluorescence, techniques de fluorescence avancées et UHRF1 / DNMT1 (Partenaire 1, U. Strasbourg) et en exaltation de fluorescence induite par les métaux et synthèse de nanoparticules d'Al (Partenaire 2, UTT).