Rupture et réparation membranaire : stratégies d’assemblage virale – membrane dynamics

Resume

Les cellules eucaryotes contiennent des compartiments membranaires qui communiquent entre eux par l’intermédiaire de vésicules dont le transport est controlé par un ensemble de protéines spécifiques. Les virus, parasites intracellulaires obligatoires, acquièrent leur membrane de l’hote par un mécanisme imitant la formation de vésicules. La famille des grands virus nucléocytoplasmique à ADN (NCLDVs) fait exception à cette règle et suit une voie non-conventionnelle pour acquérir sa membrane. Pendant l’infection des ruptures de membrane sont induites, des intermédiaires membranaires ouverts se forment, à partir desquelles se crée une structure membranaire sphérique ouverte. Cette dernière est ensuite modelée par une protéine virale d’échafaudage conservée dans la famille des NCLDVs. La sphère membranaire reste ouverte jusqu’à ce que le génome viral intègre la structure ce qui déclenche la fermeture des membranes et la transformation en virion infectieux. Nous proposons que cet assemblage peu commun de membranes soit controlé, dans la famille des NCLDVs, par un mécanisme qui implique des protéines (virales) et des lipides. Ensemble ils interviendraient dans les ruptures de membrane, la stabilisation des extrémités coupées, la formation de sphère ouverte et la fermeture après intégration du génome.
Nos récentes analyses par spectrométrie de masse de virus de la vaccine (VACV, membre de la famille des NCLDVs) montrent que l’enveloppe du virus est enrichie en composés lipidiques qui ont été impliqués dans la rupture et la déstabilisation de membrane. De plus des résultats préliminaires obtenus par tomographie électronique (ET) ont permis d’identifier une protéine de VACV, nécessaire à la rupture des membranes dans les cellules infectées. Dans le cadre de ce projet nous rechercherons des protéines partenaires qui interagiraient avec la protéine de VACV identifiée. La protéine de VACV connue sera exprimée et purifiée avec et sans protéines partenaires et les structures seront analysées par microscopie électronique à froid et par cristallographie aux rayons X. Pour cette dernière nous travaillerons en collaboration avec le Dr. Coulibaly (Monash, Melbourne), expert en cristallographie de protéines virales, en particulier de protéines de VACV. En parallèle nous continuerons l’analyse lipidique pour identifier les composés lipidiques mineurs et les classes de lipides spécifiques associés au VACV purifié. Nous proposons de complémenter ces données par une analyse en spectrométrie de masse de structures de membranes ouvertes de VACV isolées et purifiées à partir de cellules infectées. Le role de lipides spécifiques impliqués dans la rupture de membrane sera déterminé in vitro et in vivo. In vitro la protéine de VACV nécessaire à la rupture sera insérée dans des membranes artificielles (liposomes) reconstituées à partir des lipides identifiés par spectroscopie de masse comme étant enrichis dans la membrane virale. L’effet de la protéine sur les liposomes sera analysé par libération du contenu et tomographie électronique à froid. In vivo nous chercherons à inhiber la synthèse de lipides spécifiques dans les cellules infectées et jugerons des effets produits sur l’assemblage de VACV par tomographie électronique.
Nos études vont aider à comprendre les mécanismes de rupture membranaire ainsi que leur réparation et pourraient trouver des applications dans le domaine de transport ciblé de composés dans les cellules. Il serait aussi possible de comprendre pourquoi ce mécanisme qui, rare chez les eucaryotes d’aujourd’hui, était présent chez les eucaryotes/archées/bactéries, a été perdu pendant l’évolution.